次世代シークエンス（NGS）関連製品特集

従来のDNAシークエンシング法であるサンガー法（ジデオキシ法）よりも、より迅速・よりハイスループット・より安価に塩基配列解読を行うために次世代シークエンシング（NGS）法は開発されました。
NGSのシークエンシング法には、参照ゲノム配列が未知の生物種を対象としたde novoシークエンシング（新規に行われる塩基配列解読）もありますが、多くの場合、解読した塩基配列を参照ゲノム配列とマッチングをさせます。

参照ゲノム配列とのマッチングを行うことにより、目的DNA配列量の絶対定量を行ったり、SNV（一塩基多型）や、SV（構造多型）、INDEL（挿入欠失）、 CNV（コピー数多型）、転座・融合遺伝子などの遺伝子変異を検出することができます。また、がん細胞中の後天的に獲得された（蓄積された）体細胞変異の総量を示すTMB（Tumor Mutational Burden：腫瘍遺伝子変異量）のように、NGSにより求められる新しいがんマーカーもあります。
さらには、生物の体内・皮膚、あるいは土壌などに存在する微生物の集まりである細菌叢（さいきんそう；マイクロバイオーム）中のすべてのDNAまたはRNAをNGS解析し、細菌叢に含まれる微生物のプロファイリングを行うマイクロバイオーム解析も、研究が急速に発達している分野です。

次世代シークエンシング（NGS）によるハイスループットな塩基配列解読には、パイロシークエンシング、ion torrent、nanoporeシークエンシングなどいくつかの手法があります。Illumina社の手法が最も一般的であるため、ここでは同社の手法であるSequence by Synthesis法（合成によるシークエンシング）について説明いたします。この手法は、調製したライブラリーを用いたクラスター形成と、それに続く実際のシークエンシングプロセスの2つの部分からなります。

アダプターは、シークエンシングを行うDNA鎖（またはcDNA鎖）の末端に結合させた短い合成オリゴヌクレオチドで、2つの機能を有しています。その1つは、このアダプターの配列と、シークエンサーのフローセル表面に高密度で共有結合している2種類のオリゴ配列は相補的になっており、DNA鎖はフローセルに一過的にハイブリダイズすることができます。
もう1つは、シークエンシング時に使用されるポリメラーゼのプライミング部位として機能することです。DNA鎖にアダプターをライゲーションした後、多くの場合、PCRによってバーコード配列と呼ばれるユニークな配列を付加するインデックス化が行われます。
このバーコード配列により、プールした試料を用いてのシークエンシング時に、それぞれを識別することが可能となります。プールとは多数の異なる試料を既知の濃度で一緒に混合してフローセルに添加することにより、同時にシークエンシングすることができるようにするプロセスです。試料のプールは、時間とコストを節約するために行われます。 アダプターのライゲーションとインデックス化を行うと、調製したライブラリーはシークエンシングの準備が完了します。

クラスターを生成後、reverse鎖を切断・洗い流し、forward鎖のみをシークエンシングに使用します。不要なプライミングを防ぐために、3’末端をブロックします。
最初のsequencing primerから伸長してシークエンシングを行うことで、「read1」すなわち「forward read」が得られます。これは、元のフラグメントの5’から3’方向へオリゴ鎖の配列を読み取っています。

read1の読み取り終了後、リード生成物を洗い流します。次いで、テンプレートにindex read primerをハイブリダイズさせ、同様にindex readを行います。これにより、バーコード配列を含めた読み取りが行われて、個々の試料由来の読み取りのソートが可能となります。index readの読み取り終了後、リード生成物を洗い流し、テンプレートの3’末端を脱保護します。テンプレートは折り畳まれ、再びフローセル上の第2のオリゴに結合することができるようになります。その後、第１のindexと同様に、第2のindexの読み取りを行います。第2のindexを読み取った後、ポリメラーゼによりオリゴ鎖を再び伸長させて、ブリッジ構造を形成させます。次いで、相補鎖を直線化して、forward鎖を洗い流します。その後、reverse鎖テンプレートの3’末端をブロックします。
第2のsequencing primerを加え、同様の操作により「read2」すなわち「reverse read」が得られます。
このプロセス全体で、フローセル内のすべてのフラグメントを示す数百万のリードが生成されます。

DNAのNGS解析法には以下のものがあります。

また、エピジェネティクス解析で用いられるBisulfite変換シークエンシング、MeDIP-seq、ChIP-seq、ATAC-seqなどのように、研究目的に応じて試料DNAを処理した後や、標的DNAを濃縮した後にライブラリー調製を行う様々な手法があります。

RNA-seq以前は、遺伝子発現の検出に最適なテクノロジーはマイクロアレイでした。マイクロアレイは、試料がハイブリダイズすることにより蛍光を発する、既知配列を用いた数千の定義済みスポットで構成されています。
一方、RNA-seqはより用途が広い、強力なテクノロジーで、その対象は既知のゲノム配列に限定されません。RNA-seqは特定のプローブに依存しないため、参照ゲノムがない非モデル生物や新規生物のシークエンシングを行えます。RNA-seqは、新規転写産物の配列決定のほか、選択的スプライシングバリアント・一塩基多型（SNP）・挿入／削除、その他のRNA変異を検出できます。
プローブ依存型のマイクロアレイと比較して、プローブとプライマーが不要なことによりRNA-seq実施時のバイアスも低減します。また、RNA-seqは技術の進展につれて、ますます安価になりつつあります。さらにRNA-seqは、リードをゲノムの該当領域にマッピングすることができるため、マイクロアレイと比較してバックグラウンドのノイズが少なくなります。RNAの相対的発現量を検出するマイクロアレイに比べ、絶対的定量を行えるRNA-seqは、より正確なRNA発現レベルを決定でき、実験間での比較が可能となります。 RNA-seqの一般的なアプリケーションには、遺伝子発現差異解析、新規遺伝子同定、スプライスバリアント分析などがあります。

RNAそのものを直接シークエンシングする方法もありますが、RNAは不安定な分子であるため、ほとんどの場合は、RNAからcDNAへ逆転写する操作をまず行います。
様々なアプリケーションに対応するために、それぞれのRNA-seqのワークフローには異なる点がありますが、共通してライブラリー調製、シークエンシング、および分析という3つの主要なステップがあります。

RNAのNGS解析法には以下のものがあります。

研究における様々な要望に応えるために、今後も、多種多様な技術がRNA-seqに適用されることが期待されます。

必要に応じて、標的配列の選択を行います。選択方法は標的配列の濃縮または過剰に存在する転写産物の枯渇化で、過剰な転写産物の枯渇化は、プローブベースまたは酵素法で行います。このステップは、下流の操作の効率の点で重要です。細胞由来RNAの80～95％がリボソームRNA（rRNA）であるため、total RNA試料からできるだけ多くのrRNAを除去することが重要です。
rRNAやグロビンmRNAなどの過剰な転写産物は、シークエンシング実施時の読み取りの大部分を占め、コスト、試薬量、および読み取り深度の無駄となります。最適化されたRNAシークエンシング実施のためには、これらの過剰に存在する転写産物を除去することが最善の結果をもたらします。

目的の転写産物のシークエンシングリードの数を増やす方法は試料を濃縮することです。ターゲット濃縮の一般的な方法はmRNAの選択であり、多くの場合、ポリd(T)磁気ビーズを介して行われます。磁気ビーズに共有結合したポリd(T)配列は、成熟したmRNAの3'末端のポリ(A)テールに対して相補的となります。

このプロセスでは、試料中の転写物のプールに偏りが生じることがあります。転写物が非常に長い場合や、試料中の取り扱いが荒い場合、転写物がせん断され、mRNAの3'末端が過剰に表現されてしまうことがあります。また、この方法では、通常はポリ(A)テールを持たないマイクロRNA（miRNA）やロングノンコーディングRNA（lncRNA）など、関心のあるその他のRNAを濃縮することができません。

酵素によるrRNA枯渇は、プローブを必要としません。その代わりにRNAとcDNAのハイブリダイゼーション反応の速度論が関与します。

このプローブを使用しない酵素による枯渇法の利点は、汎用性があり、RNA試料の生物種に応じた製品を個別に購入する必要がなく、1つのキットですべてを行うことができるということです。非モデル生物を対象とした研究で、従来はその生物特有のプローブパネルを開発する必要があった場合に特に有効です。
酵素による枯渇法のもう一つの利点は、枯渇バイアスの低減です。プローブ法では、プローブに結合するRNAのみが枯渇するのに対し、酵素法では、最も豊富に存在するRNAを最初に最も効率的に枯渇させることができます。

※ この後に続く、cDNA試料へのアダプターのライゲーションや、シークエンシング操作などについてはこちらをご覧下さい。

※ マイクロバイオーム（微生物叢）研究関連製品（試料保存試薬・核酸精製キット・微生物叢標準品など）についてはこちらもご覧下さい。

細菌叢（さいきんそう；マイクロバイオーム）は、生物の体内・皮膚、あるいは土壌などに存在する微生物の集まりのことです。腸内のものは特に「腸内フローラ」と呼ばれます。
マイクロバイオーム解析は、細菌叢中のすべてのDNAまたはRNAを抽出し、これをNGS（次世代シークエンシング）解読することにより、細菌叢に含まれる微生物のプロファイリングを行う手法です。シークエンシングの技術、能力の向上とコストの低下により、研究が急速に発達している分野のひとつです。

ライブラリー調製法としては主に以下の手法が用いられ、いずれの手法もNGS解読後に得られた情報を参照ゲノム配列とマッチングして生物種の同定を行います。

正確なマイクロバイオーム解析を行うためには、以下の要因によるバイアスを排除する必要があります。

マイクロバイオーム解析で得られた結果を各種手法で画像化したもの

※ エピジェネティクス解析関連製品についてはこちらもご覧下さい。

エピジェネティクス解析の分野においても、NGS（次世代シークエンシング）は下記のとおり幅広く用いられています。

最もよく知られているエピジェネティックなマーカーはDNAメチル化です。5-メチル化シトシン（5-mC）はシトシン（C）にメチル基が共有結合しているため、標準的な塩基配列決定法ではDNAメチル化を直接分析することはできません。Bisulfite変換はCから5-mCへの変化を同定する場合のゴールドスタンダードとなっています。この化学的プロセスでは、非メチル基シトシンのみを脱アミノ化し、ウラシルに変換します。Bisulfite変換した試料から調製したライブラリーをNGS（次世代シークエンシング）解読すると、メチル化シトシンは配列中で「C」として読まれ、ウラシルに変換されたシトシンは「T」として読まれます。これらの配列を参照ゲノムと比較することで、1塩基の分解能でメチル化の割合を計算することができます。

Bisulfite変換を用いたNGS解析には、以下の手法が主に用いられています。

RRBS解析で得られたDNAメチル化情報のヒートマップ

メチル化DNA免疫沈降法（MeDIP）は、Bisulfite変換を用いずに、5-mCを標的とした抗体を用いて、断片化されたゲノムDNAからメチル化DNAを濃縮させます。この濃縮された画分は、ゲノム全体のメチル化解析に使用することができます。

ヒストン修飾は、ヒストンのコアタンパク質に対する共有結合的な修飾であり、遺伝子発現を変化させます。

クロマチン免疫沈降法（ChIP）は、タンパク質をDNAに架橋した後、タンパク質特異的抗体を用いて、タンパク質に結合したDNA断片を選択的に沈殿・濃縮させます。濃縮されたDNAをNGS解析するChIP-seqは、特定のヒストン修飾のゲノムワイドなプロファイルや、ゲノム内の転写因子や他の酵素結合部位の解析に使用できます。また、ChIP-seqを改良した手法として、ChIP-exo、ChIPmentation、CUT＆RUN、CUT&Tag、改良型CUT＆RUN（cTIP）などの手法があります。

ゲノム中のヌクレオソームや転写因子が結合していない（開いている）領域であるオープンクロマチン領域は、遺伝子発現と関連しているため、そのマッピングはクロマチン構造変化の理解に有用です。クロマチン中のDNAへのアクセス性を測定するために最も一般的に使用されている手法は、ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin）となります。

上記の各手法で得られた情報と、RNAシークエンシングを組み合わせることで、エピジェネティックな変化の影響を「マルチミック」なアプローチで測定することが可能になりました。さらに強力な解析法は、これらの手法をシングルセルレベルで組み合わせて解析することです。近年、シークエンシング能力が急速に向上し、コストが大幅に削減されたことから、シングルセルのエピゲノミクスを解析して、細胞タイプに特化したマップを作成することへの関心が高まっています。これにより、疾患における細胞の発生、同一性、機能を新たなレベルで理解することが可能になります。
例えば、マウス肝臓のシングルセルを対象としたWGBSにより、肝臓組織内における極めて高レベルなDNAメチル化の不均一性が明らかになりました。