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セルフリーDNAなどの断片化DNAをバイサルファイト処理し、WGBSライブラリーを調製するキット Zymo-Seq Trio WGBS Library Kit

掲載日情報:2023/07/06 現在Webページ番号:68488

わずか5~10 ngのセルフリーDNA(cfDNA)・FFPE試料由来DNA・断片化されたゲノムDNA(gDNA)から、DNAメチル化解析に用いるWGBS(Whole Genome Bisulfite Sequencing)ライブラリーを調製するキットです。独自のアダプターであらゆるサイズのDNA断片を捕捉するダイレクトライゲーション法により、試料DNAの断片末端のメチル化状態を正確に保持したライブラリーを調製できます。
本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。


Cell Free DNA WGBS Library Kitメチル化率
他社キットメチル化率

リード全体にわたり正確なメチル化検出が可能
本キットで調製したライブラリーは、従来の方法によく見られるライブラリー調製時に生じるバイアスを最小限に抑える。バイアスのないライブラリーは、リード全体にわたって一貫したメチル化レベルを有する。
従来の方法では末端修復ステップの際に、損傷したDNA末端に外来のヌクレオチドを組み込むため、DNA断片の3'末端に著しいメチル化の偏りが生じる。一方、本キットはアダプターを直接ライゲーションするため、末端修復の必要がなく、試料DNA断片の末端に存在するメチル化の完全性が保たれる。
各キットで調製したライブラリーについて、マップされたリードの各位置にわたる平均CpGメチル化レベルによりM-Biasプロットを作成したところ、本キット(左)がRead 1とRead 2の両方で一貫したCpGメチル化を示すのに対し、A社製品(右)は著しいバイアスが見られた。


特長

  • cfDNAやFFPE由来DNAなどのサイズが小さいDNA断片、または分解されたDNA断片からのライブラリー調製に最適です。
  • cfDNA・FFPE由来DNAの断片末端のメチル化状態を正確に保持したライブラリーを調製できます。
  • 調製したライブラリーは、すべてのIlluminaプラットフォームに対応していますが、HiSeq、NextSeq、NovaSeqのご使用をお勧めします。
  • 試料DNAの種類:精製セルフリーDNA(cfDNA)、FFPE由来DNA(平均サイズ:300~600 bp)、断片化されたゲノムDNA(平均サイズ:300~600 bp)
  • 試料DNA量:5~10 ng
  • 全所要時間:~6時間(実操作時間:~2時間)

精製cfDNAは、RNAやゲノムDNAの混入を最小限にする必要があります。抽出操作後にDNA Clean & Concentrator Kitで濃縮を行うこともできます。cfDNAは、キットのDNA elution bufferや、水、TEバッファーに溶解したものを使用できます。


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操作方法概略

1. バイサルファイト処理、2. ダイレクト法によるアダプターライゲーション、3. PCRによるIndex配列付加のわずか3ステップ操作となります。

操作方法概略

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使用例

さまざまなドナー由来のcfDNAからのライブラリー調製

さまざまなドナー由来のcfDNAからのライブラリー調製

A1:分子量マーカー
B1:健常な59歳ドナー
C1:肺がんNSCLCステージⅣの66歳ドナー
D1:腺がんステージⅣの69歳ドナー
すべてのライブラリーは5 ngのcfDNAを用いて、9 index PCRサイクルで増幅により調製した。
得られたライブラリーをAgilent 4200 TapeStation HS D1000で解析したゲルイメージ。


調製したライブラリーの特性

調製したライブラリーの特性

健常な男性ドナー由来の5 ngのcfDNAを用い、9 index PCRサイクルで増幅によりライブラリー調製した。得られたライブラリーをAgilent 4200 TapeStation HS D1000で解析したゲルイメージ(左)および電気泳動図(右)。
左図中、A1:分子量マーカー、B1:最終的なcfDNA WGBSライブラリー

本キットで調製したライブラリーは、通常、下記2~3本のピークを有する。
約130~180 bp:アダプターダイマー由来のピーク(存在しない場合もある)、約290~350 bp:モノヌクレオソーム由来のピーク、約480~550 bp:ジヌクレオソーム由来のピーク


調製したライブラリーによるメチル化解析例

評価項目
バイサルファイト処理での変換率99.6%
アライメント率(マッピング率)81.5%
インサートサイズの中央値158 bp
CpGのカバー率(>5×)81.9%
プロモーターのカバー率(>50×)92.1%
CpGアイランドのカバー率(>50×)92.7%

5 ngのcfDNAから本キットを用いてライブラリーを調製し、NovaSeq 6000を用いて約400M PEのシークエンシングを行った。
得られたリードは、Bismarkを用いてhg38へのアライメントを行い、MethlDackelを用いてメチル化検出を行った。


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Zymo Research社のDNAメチル化解析用ライブラリー調製キットの一覧

製品名をクリックすると各製品の詳細を、商品コードをクリックすると価格表をご覧になれます。

製品名
(商品コード)
Zymo-Seq Trio WGBS Library Kit
(#D5462 / #D5463
Zymo-Seq WGBS Library Kit
(#D5465
Pico Methyl-Seq Library Prep Kit
(#D5455 / #D5456
Zymo-Seq RRBS Library Kit
(#D5460 / #D5461
カバーされる領域 ゲノム全体 ゲノム全体 ゲノム全体 ゲノム中のCpG領域
試料DNAの
必要量
5~10 ng 10~100 ng 10 pg~100 ng 10~500 ng
試料DNAの品質 cfDNAや、FFPE試料から抽出したDNAなど小さく分解されたDNA 損傷のないDNA
(>10 kb)
損傷のないDNA、FFPE試料から抽出したDNA、cfDNA、分解されたDNA 損傷のないDNAが望ましい
FFPE試料から抽出したDNA、およびcfDNAに適合することを確認済み
対応生物種 全生物種 全生物種 全生物種 哺乳動物(ヒト、マウス、ラットなど)
他の生物種については、事前にゲノムのカバー率の評価が必要
推奨するリード数
(ヒトゲノムの場合)
5億リード 6億リード 6億リード 4千万リード
特長 cfDNA・FFPE試料から抽出したDNAの断片末端のメチル化状態を正確に保持 簡便な操作で、わずか4時間で調製可能 少量のDNA試料や劣化したDNA試料にも適用可能 CpG領域を高い割合、かつ高い再現性でカバーできる

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Zymo-Seq Trio WGBS Library KitのFAQ

クリックで展開します

Q-1. 5 ng以下のcfDNA量でライブラリーを調製できますか?

A-1. 5 ngより少ない試料量でもライブラリーを調製することは可能ですが、その場合、ライブラリーの品質は保証されません。一般的に試料量が少ないと、最終ライブラリー中のアダプターダイマーの割合が増加します。
最良の結果を得るためには、5 ng以上の試料量となるように、可能な限り濃縮することをお勧めします。試料は、DNA Clean & Concentrator Kitを使用して濃縮することもできますし、同じカラムをクリーンアップに再利用して、バイサルファイト変換ステップ中に濃縮することもできます。



Q-2. 10 ng以上のcfDNA量でライブラリーを調製できますか?

A-2. 10 ngを超える試料量でライブラリーを調製することは可能ですが、その場合、ライブラリーの品質は保証されません。最良の結果を得るためには、10 ng以下の試料量となるように、試料を希釈することをお勧めします。



Q-3. キットに含まれるアダプターライゲーション用試薬について4回以上融解を行いました。調製したライブラリーは問題ないでしょうか?

A-3. Adapter ligation buffer 2(オレンジ色キャップ)、Adapter ligation buffer 3(黄色キャップ)、Adapter ligation master mix(緑色キャップ)については、4回以下の凍結融解をお勧めします。凍結融解を4回繰り返すと、調製したライブラリーの品質にばらつきが生じることがあります。凍結融解の回数を最小限にするために、これらのバッファーの最初の使用時に、必要に応じて小分け分注することをお勧めします。
なお、Adapter ligation buffer 1(赤色キャップ)は、凍結融解の繰り返しにそれほど敏感ではないので、4回以上融解しても影響を受けません。



Q-4. Zymo-Seq UDI primerは、個別プライマーまたはプレミックスプライマーのいずれかのセットでしょうか?

A-4. 各チューブ/ウェルには、forwardとreverseのプライマーのプレミックスが含まれており、これらは固有のi5およびi7インデックス配列を有します。各UDIプライマーのプレミックスでの濃度は合計5 μM(各プライマーについて2.5 μM)となります。



Q-5. 調製したライブラリーについて、必要なリード長およびシークエンス深度のお勧めはどのくらいでしょうか?

A-5. 調製したライブラリーは、どのようなサイクル数にも適していますが、サイクル数を増やすと、より短いライブラリー断片のために、より大量のアダプタートリミングが必要となります。ほとんどのアプリケーションでは、100塩基のペアエンド(PE)リードで十分であり、ゲノムワイドなカバレッジのための高品質なデータを大量に得ることができます。
シークエンス深度は、ゲノムサイズ、ゲノムのカバレッジ、必要な部位のカバレッジによって異なります。一般的には、CpG部位あたり10倍のカバレッジを目指すことが推奨されます。
100 bp PEシークンスでは、ヒトcfDNAのWGBSでは10倍のCpGカバレッジで少なくとも5億リード、マウスcfDNAのWGBSでは10倍のCpGカバレッジで少なくとも4億リードをお勧めします。




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cfDNA特集へのリンク
エピジェネティクスオンラインカタログ リンク

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キット内容

別途必要な試薬、装置類については、製品プロトコルをご確認下さい。
各キットコンポーネント名をクリックすると、単品の価格表をご覧いただけます。
印で示したキットコンポーネントは、EZ DNA Methylation-Lightning Kit(#D5030T、#D5030、#D5031)に含まれています。

キット外観

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価格

[在庫・価格 :2025年02月15日 18時55分現在]

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Zymo-Seq Trio WGBS Library Kit (24 preps)
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[在庫・価格 :2025年02月15日 18時55分現在]

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Zymo-Seq Trio WGBS Library Kit (24 preps)

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  • 商品コード:D5462
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[在庫・価格 :2025年02月15日 18時55分現在]

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EZ DNA Methylation-Lightning Kit (10preps)
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メチル化DNA検出キット。小包装のサンプルあり。
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メチル化DNA検出キット。
別包装品 別包装品あり
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別包装品 別包装品あり
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お問い合わせ先

(テクニカルサポート 試薬担当)

reagent@funakoshi.co.jp

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表示価格に、消費税等は含まれていません。一部価格が予告なく変更される場合がありますので、あらかじめご了承下さい。