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トランスラトーム/de novoプロテオーム解析用キット AHARIBO Kit

掲載日情報:2021/05/07 現在Webページ番号:68157

Immagina BioTechnology社独自のRibo-MINATI技術により、翻訳複合体のプルダウンを行う製品です。新生ペプチドへAHA(L-Azidohomoalanine)を取り込ませるAHARIBO Core Kitと、各アプリケーションに適した形で翻訳複合体のプルダウンを行うAHARIBO Moduleを組合せて使用します。
Moduleには、トランスラトーム解析用のAHARIBO RNA Moduleと、de novoプロテオーム解析用のAHARIBO Protein ModuleおよびAHARIBO Western Blotting Moduleがあります。
Core Kitと、それぞれのModuleを用いることで、少量の試料から迅速に、様々な生物学的条件における翻訳/タンパク質合成の動的変化を検出することができます。
トランスラトーム解析用NGSライブラリー調製に必要な試薬がすべて含まれた AHARIBO TRANSLATOME RNAseqについてはこちらをご覧下さい。
本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。


製品仕様変更のお知らせ

本製品は、2021年3月より、以下のとおり製品仕様を変更いたしました。

従来:
解析方法別のキットをラインナップ

解析方法製品名
RNA-seq / qPCR解析 AHARIBO RNA Kit(#AHA003-R)
LC-MS解析 AHARIBO Protein Kit(#AHA003-P)

仕様変更後:
新生ペプチドへAHAを取り込ませるAHARIBO Core Kitと、各アプリケーションに適した形で翻訳複合体のプルダウンを行うAHARIBO Moduleの組合せ

解析方法製品名
AHAの取り込み翻訳複合体のプルダウン
RNA-seq / qPCR解析 AHARIBO Core Kit
(#AHA003_12)
AHARIBO RNA Module(#M-AHA003-R)
LC-MS解析 AHARIBO Protein Module(#M-AHA003-P)
ウエスタンブロッティング解析 AHARIBO Western Blotting Module(#M-AHA003-W)


トランスラトームおよびde novoプロテオームとそれらの解析について

トランスラトーム(Translatome)は、単一の細胞内である瞬間または条件で翻訳に使用されるRNAの全体を指します。一次転写物全体を指すトランスクリプトーム(Transcriptome)よりも、新規合成されたタンパク質全体(de novoプロテオーム)との相関性が高く、ある遺伝子の発現レベル推定時により正確な値が得られます。

従来のトランスラトーム解析法としてポリソームプロファイリングやアフィニティ精製後のRNA-seqが、de novoプロテオーム解析法としてpSILACやPUNCH-Pなどのアフィニティ精製後のLC-MSがあります。しかしながら、いずれも手間を要する手法であり、また得られた結果もmRNAとタンパク質レベルの相関関係は比較的乏しくなっています。

Ribo-MINATI技術は、トランスラトームおよびde novoプロテオーム解析において信頼できる結果をもたらす手法です。


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Ribo-MINATI技術およびAHARIBOについて

Ribo-MINATI(Minimally Invasive Non-canonical Amino acid Tagging and Isolation of Ribosomes)技術は、リボソームに結合した新生ペプチド鎖内にメチオニンアナログであるAHA(L-Azidohomoalanine)を取り込ませた後に、抗体を用いずに翻訳複合体のプルダウンを行う手法です(AHARIBO:AHA-mediated RIBOsome Isoration)。

Ribo-MINATI技術について

培養細胞にAHAを添加した後、翻訳中のリボソーム上の新生ペプチドをブロックする独自の小分子(sBlock)を加えて、細胞を溶解します。
AHA標識された新生ペプチド鎖と独自のスマートビーズをクリックケミストリーにより結合させることにより、活性リボソーム複合体を分離する際のタグとして使用します。
リボソーム複合体に結合したRNAおよび新生ペプチドを分離・精製し、下流の解析に用います。
タグとしてアミノ酸類似体であるAHAを用いるため、培養細胞に安全に供給され、タンパク質合成中に新生ペプチドへ迅速かつ高感度に、非毒性、非放射性の非常に小さなアジド部分からなる標識をもたらします。


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Memo:Immagina BioTechnology社のリボソーム解析用製品群について


Immagina BioTechnology社のリボソーム解析用製品群について

RiboLace Kit / LACEseq KitおよびCircAID-p-seq Kitの詳細については、それぞれ該当のページをご覧下さい。


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特長

システム共通

  • わずか500,000細胞から解析可能です。
  • 細胞溶解から、RNAまたはタンパク質が得られるまで、わずか4時間で行えます。
  • RNAとタンパク質の並列解析が可能です。
  • 超遠心操作は不要です。

AHARIBO RNA Module

  • 本モジュールでリボソーム複合体および結合RNAを分離した後、RNA精製をし、RNA-seq解析を行うことで、トランスラトーム解析を行えます。
  • タンパク質をコードしたRNA、リボソーム関連の調節RNA、非コードで翻訳に関連するRNAの3種類を濃縮できることが示されました。
  • マウス胚性幹細胞の神経分化の動的変化において、本モジュールで同定されたトランスラトームはTotal RNAよりも、それぞれのタンパク質レベルに対して高い相関を示しました。

AHARIBO Protein Module

  • 本モジュールでリボソーム複合体および新生ペプチド鎖を分離した後、ペプチドを消化し、LC-MS解析を行うことで、de novoプロテオーム解析を行えます。
  • マウス胚性幹細胞の神経分化の動的変化において、本キットで同定されたde novoプロテオームは総タンパク質よりも、それぞれのmRNAレベルに対して高い相関を示しました。

AHARIBO Western Blotting Module

  • 本モジュールでリボソーム複合体および新生ペプチド鎖を分離した後、SDS-PAGE・ウエスタンブロッティングを行うことで、de novoプロテオーム解析を行えます。

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使用例

トランスラトーム/de novoプロテオームの解析例

AHARIBO-Ribosomal-Protein-Analysis

AHARIBOにより単離したタンパク質とプルダウン処理前のライセート(AHAを含む)について、P値(統計的優位性、縦軸、-log)とタンパク質の相対的存在量(横軸)でボルケーノプロットを作製した。
オレンジ色および青色のドットは、それぞれリボソームのlargeおよびsmall subunitを示す。

IBT-68157-13-AHARIBO-Total-RNA-Analysis

亜ヒ酸塩(Ar)処理、熱ショック(HS)処理、未処理(NT)の細胞ライセートを試料として、プルダウン処理前から抽出およびAHARIBOにより単離したtotal RNAをアガロースゲル電気泳動した。

マウス胚性幹細胞(mESCs)および分化させた初期ニューロン(EN)からAHARIBOにより単離したタンパク質の比較

マウス胚性幹細胞および分化させた初期ニューロンからAHARIBOにより単離したタンパク質についてボルケーノプロット

マウス胚性幹細胞(mESCs)および分化させた初期ニューロン(EN)からAHARIBOにより単離したタンパク質についてボルケーノプロットを作製した。
オレンジ色および紫色のドットは、それぞれ細胞骨格および神経発生関連タンパク質で、発現が上方制御されているもの。
青色、緑色、赤紫色ドットは、それぞれRNAプロセシング、タンパク質合成、マウスの多能性に関連したタンパク質で、発現が下方制御されているもの。
神経発生の初期ステージで発現するタンパク質(Map1b、Tubb3、Dync1h1など)が、EN細胞において濃縮されており、AHARIBOによりタンパク質新生のモニタリングが行えること示された。


再現性の確認

AHARIBO-RNA-Reproducible-Analysis
AHARIBO-Protein-Reproducible-Analysis

AHARIBO Kitの再現性および信頼性を確認するために、2つのマウス胚性幹細胞(mESCs)試料(Replicate A、B)について、RNAおよびタンパク質をプルダウンし、それぞれRNA-seq(左)およびLC-MS(右)で解析した。
その結果、R2≧0.98という極めて高い再現性が示された。


AHARIBOと既存法との比較

AHARIBOと既存法との比較

既存法(ショ糖密度勾配遠心法を用いたポリソームプロファイリング)またはAHARIBOで得られたRNAをNGSで解析し、プロテオーム解析結果との相関度(最大値=1)について比較した。AHARIBOの方が相関性が高いことが分かる。


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AHARIBO KitのFAQ

AHARIBO KitのFAQ (クリックで展開します)

Q-1. AHARIBOをモデル動物に使用できますか?

A-1. いいえ、AHARIBOは培養細胞に特化しています。AHAを新生ペプチドに組み込むことは、このプロトコルにとって非常に重要です。原理的には生きている動物にAHAを組み込むことは可能ですが(Calve, S., et al., Sci. Rep., 6, 32377 (2016).[PMID:27572480])、現段階では動物や生体での研究にAHARIBOをお勧めしません。



Q-2. ビーズを誤って凍らせてしまったのですが、まだ使えますか?

A-2. 一般的に、ビーズの凍結は推奨されていませんが、ビーズの特性を妨げるものではありません。



Q-3. 溶解を進める前に、細胞をsBlockで処理する必要がありますか?

A-3. はい。sBlockは、翻訳をブロックし、新生ペプチドをリボソーム上に固定するために細胞に添加する必要があり、AHARIBOにとって必須のステップです。sBlockは、キットに含まれるLysis buffer(LB)やW buffer(WB)にも含まれています。誤ってsBlockとのインキュベーションをスキップした場合、Lysis buffer中のsBlockがリボソーム上の新生ペプチドを安定化させる働きをします。



Q-4. AHARIBO実験用のライセートはどのように保存すれば良いですか?

A-4. 細胞ライセートは、-80℃で1~2ヶ月程度の保存をお勧めしています。



Q-5. RNase阻害物質を結合させたビーズ(ステップ1の後)を保存しておいて、後で操作を続けることはできますか?

A-5. はい、ステップ1で中断することができます。ビーズを+4℃で一晩保存することをお勧めします。ビーズを冷凍しないで下さい。



Q-6. 試料としてどのくらいの量のライセートを使用しますか?

A-6. 0.2 a.u.(260 nm)に相当するライセート量から始めることをお勧めします。なお、AHARIBO RNAは、0.002 a.u.のHeLaライセートでの使用実績があります。



Q-7. 吸光度はどのように計算すれば良いですか?

A-7. Lysis bufferをブランクとして、260 nmでライセートを測定し、この吸光度値を使って必要量を算出するだけです。例えば、ライセートの吸光度(A260)が10に相当する場合、これは10 a.u./ml(= 0.01 a.u./μl)に相当します。つまり、0.2 a.u.から始めたい場合は、20μlのライセートが必要となります。



Q-8. AHARIBO Kitで処理する前に、試料を改善する方法はありますか?

A-8. 試料の洗浄は、細胞ライセートをショ糖密度勾配遠心する標準的なプロトコルの使用により可能です。これにより、合成された全長のタンパク質が除去され、新生鎖を含むリボソームの画分が濃縮されます。



Q-9. どのような生物種にAHARIBOを使用することができますか?

A-9. AHARIBOは、理論上は真核生物のリボソームで使用できますが、現時点では、哺乳類細胞とマウス個体で検証されています。sBlockは真核生物に特異的な翻訳阻害物質であるため、原核生物には作用しません。





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キット内容

AHARIBO Core Kit

  • AHA
  • Lysis buffer(LB)
  • L-Leucine(LL)
  • sBlock
  • Ligand(G)

AHARIBO RNA Module

  • W-buffer(WB)
  • sBeads(sB)
  • Washing solution(WSS)

AHARIBO Protein Module

  • W-buffer(WB)
  • dBeads(dB)
  • Urea washing solution(UWS)

AHARIBO Western Blotting Module

  • W-buffer(WB)
  • sWBeads(sWB)
  • Washing solution(WSS)

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価格

AHARIBO Core Kit

[在庫・価格 :2024年03月29日 11時15分現在]

※ 表示されている納期は弊社に在庫が無く、取り寄せた場合の納期目安となります。
詳細 商品名
  • 商品コード
  • メーカー
  • 包装
  • 価格
  • 在庫
  • 法規制等
納期 文献数
AHARIBO core kit, 12 Reactions
3~4週間 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 2
説明文
翻訳複合体のプルダウンを行うために,新生ペプチドへAHAを取り込ませるキット。別売りのAHARIBO Moduleと組み合わせることで,トランスラトーム(Translatome)解析や,de novoプロテオーム解析を行える。
法規制等
保存条件 -20℃ 法規備考
掲載カタログ ニュース2021年12月15日号 p.16

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AHARIBO core kit, 12 Reactions

文献数: 2

説明文 翻訳複合体のプルダウンを行うために,新生ペプチドへAHAを取り込ませるキット。別売りのAHARIBO Moduleと組み合わせることで,トランスラトーム(Translatome)解析や,de novoプロテオーム解析を行える。
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保存条件 -20℃ 法規備考
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AHARIBO RNA Module

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AHARIBO Module RNA, 6 Reactions
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別売りのAHARIBO Core Kitと組み合わせることで,トランスラトーム(Translatome)解析をNGSで行える。
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AHARIBO Module RNA, 6 Reactions

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説明文 別売りのAHARIBO Core Kitと組み合わせることで,トランスラトーム(Translatome)解析をNGSで行える。
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AHARIBO Module Protein, 6 Reactions
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AHARIBO Module Protein, 6 Reactions

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AHARIBO Western Blotting Module

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AHARIBO Module Western Blotting, 6 Reactions
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別売りのAHARIBO Core Kitと組み合わせることで,de novoプロテオーム解析をWestern Blotting解析で行える。
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AHARIBO Module Western Blotting, 6 Reactions

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法規制等
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掲載カタログ ニュース2021年12月15日号 p.16

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お問い合わせ先

(テクニカルサポート 試薬担当)

reagent@funakoshi.co.jp

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