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トランスラトーム／de novoプロテオーム解析用キット AHARIBO Kit
掲載日情報：2024/06/04 現在Webページ番号：68157
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- トランスラトームおよびde novoプロテオームとそれらの解析について
- AHARIBO技術について
- 特長
- 使用例
- AHARIBO KitのFAQ
- Immagina BioTechnology社のリボソーム解析用製品について
- 関連した特集記事
- キット内容
- 価格
トランスラトームおよびde novoプロテオームとそれらの解析について
トランスラトーム（Translatome）は、単一の細胞内である瞬間または条件で翻訳に使用されるRNAの全体を指します。一次転写物全体を指すトランスクリプトーム（Transcriptome）よりも、新規合成されたタンパク質全体（de novoプロテオーム）との相関性が高く、ある遺伝子の発現レベル推定時により正確な値が得られます。
従来のトランスラトーム解析法としてポリソームプロファイリングやアフィニティ精製後のRNA-seqが、de novoプロテオーム解析法としてpSILACやPUNCH-Pなどのアフィニティ精製後のLC-MSがあります。しかしながら、いずれも手間を要する手法であり、また得られた結果もmRNAとタンパク質レベルの相関関係は比較的乏しくなっています。
従来の手法の課題を克服するためにAHARIBOは開発されました。AHARIBO技術は、トランスラトームおよびde novoプロテオーム解析において信頼できる結果をもたらす手法です。
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AHARIBO技術について
本技術は、リボソームに結合した新生ペプチド鎖内にメチオニンアナログであるAHA（L-Azidohomoalanine）を取り込ませた後に、抗体を用いず、磁気ビーズによって翻訳複合体のプルダウンを行う手法です（AHARIBO：AHA-mediated RIBOsome Isolation）。
培養細胞にAHAを添加した後、翻訳中のリボソーム上の新生ペプチドをブロックする独自の小分子（sBlock）を加えて、細胞を溶解します。AHA標識された新生ペプチド鎖と独自のスマートビーズをクリックケミストリーにより結合させることにより、活性リボソーム複合体を分離する際のタグとして使用します。リボソーム複合体に結合したRNAおよび新生ペプチドを分離・精製し、下流の解析に用います。
タグとしてアミノ酸類似体であるAHAを用いるため、培養細胞に安全に供給され、タンパク質合成中に新生ペプチドへ迅速かつ高感度に、非毒性、非放射性の非常に小さなアジド部分からなる標識をもたらします。
AHARIBO技術紹介動画（英語版、約2分）
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特長
システム共通
- わずか500,000細胞から解析可能です。
- 細胞溶解から、RNAまたはタンパク質が得られるまで、わずか4時間で行えます。
- RNAとタンパク質の並列解析が可能です。
- 超遠心操作は不要です。
AHARIBO RNA System
- 新生ペプチドへAHAを取り込ませ、リボソーム複合体を結合するRNAも含めてプルダウンにより分離した後、RNA精製を行う製品です。
- 精製したRNAを対象にRNA-seq解析を行うことで、トランスラトーム解析を行えます（ライブラリー調製のための試薬は含まれません）。また、精製RNAは断片化していないため、qPCRでの解析も可能です。
- タンパク質をコードしたRNA、リボソーム関連の調節RNA、非コードで翻訳に関連するRNAの3種類を濃縮できることが示されました。
- マウス胚性幹細胞の神経分化の動的変化において、本キットで同定されたトランスラトームはTotal RNAよりも、それぞれのタンパク質レベルに対して高い相関を示しました。
AHARIBO Protein System
- 新生ペプチドへAHAを取り込ませ、リボソーム複合体および新生ペプチド鎖をプルダウンにより分離し、ペプチド鎖をビーズに結合した状態で回収する製品です。
- 回収したペプチド鎖を消化し、LC-MS解析を行うことで、de novoプロテオーム解析を行えます。
- マウス胚性幹細胞の神経分化の動的変化において、本キットで同定されたde novoプロテオームは総タンパク質よりも、それぞれのmRNAレベルに対して高い相関を示しました。
AHARIBO RNA and Protein System
- 翻訳RNAのqPCRやRNA-seqなどのRNA解析とde novoタンパク質合成解析を並行して行うことができます。
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使用例
再現性の確認①
AHARIBO Kitの再現性および信頼性を確認するために、2つのマウス胚性幹細胞（mESCs）試料（Replicate A、B）について、RNAおよびタンパク質をプルダウンし、それぞれRNA-seq（左）およびLC-MS（右）で解析した。
その結果、R2≧0.98という極めて高い再現性が示された。
再現性の確認②
AHARIBO Translatome RNA-seqは、すべての反復実験（Replicate1～3）間で優れた再現性と相関性を示した。
AHARIBOと既存法との比較
既存法（ショ糖密度勾配遠心法を用いたポリソームプロファイリング）またはAHARIBOで得られたRNAをNGSで解析し、プロテオーム解析結果との相関度（最大値＝1）について比較した。AHARIBOの方が相関性が高いことが分かる。
AHARIBO Translatome RNA-seqによる正確なタンパク質レベルの予測
グローバルな遺伝子発現変化を誘導する処理を行った条件下で本法を実施し、実際のプロテオームとの類似性を確認した。図に示した3種のターゲットについて、total RNA-seqとAHARIBO Translatome RNA-seqで得られたFold Change（WT vs Treated）を比較した（図A）。
またウェスタンブロット解析により、AHARIBO Translatome RNA-seqはtotal RNA-seqと比較してタンパク質レベルを予測する能力が高いことが明らかになった（図B）。
上記の結果をまとめると、3種のターゲットにおいて本法とウエスタンブロット法とは同等のレベルを示したが、Total RNA-seqで得られた値は有意に低値であった（図C）。
