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独自の磁気ビーズでRibo-Seqに適した活性型リボソームを分離 RiboLace Kitシリーズ

掲載日情報：2024/06/24 現在Webページ番号：68814

イマジナ バイオテクノロジー /
Immagina BioTechnology S.R.L.
[メーカー略称：IBT]

リボソームの機能解析法であるリボソームプロファイリング（Ribo-Seq）用の試料分離・ライブラリー調製キットです。リボソームに結合して翻訳を阻害する独自のピューロマイシン含有分子が結合した磁気ビーズによるプルダウン法を用いて、抗体やタグ配列を用いずに活性型リボソームのみを分離できます。
※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

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RiboLaceテクノロジー

RiboLace Scheme

RiboLaceテクノロジーは、RPF（Ribosome protected fragment）を単離するためのIMMAGINA社の独自技術です。この技術の核心は3Pと呼ばれる独自のピューロマイシン誘導体で、これがビオチン分子と共有結合しながら活性リボソームと相互作用します。試料をまずCycloheximideで処理し、mRNA断片上にリボソームをブロックします（推奨ステップ）。それと並行して、磁気ビーズを3Pで機能化しておきます。試料のRNaseⅠによる消化後、磁気ビーズを反応液に加え、活性リボソーム複合体をプルダウンします。最終的には、単純な段階的な溶出によってRPFが精製されます。この技術のオリジナルの概念実証は、2018年にCell Reportに掲載されました。

参考文献

Clamer, M., et al., "Active Ribosome Profiling with RiboLace.", Cell. Rep., 25 (4), 1097～1108.e5 (2018). [PMID:30355487]

RiboLace技術紹介動画（英語版、約2分）


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RiboLace KitのRNA抽出までの操作方法概略

RiboLace Kitの操作方法概略
  1. RiboLaceを結合させる際に、mRNA上のリボソームをブロックし、またリボソームの分離を弱めるために細胞をcycloheximide＊1で5分間処理した後、Lysis bufferで細胞を溶解する。
  2. RiboLace magnetic beadsを準備する（Beads functionalization）。
  3. RNaseⅠ（Nux solution）でmRNAのリボソーム未結合部分を分解する。
  4. RNase阻害物質＊1を加えて分解反応を停止後、2で用意したRiboLaceを加えて穏やかに撹拌しながらインキュベートする。
  5. 1.5 mlチューブ用マグネットスタンド＊1でビーズを分離し、洗浄する。リボソームは、ビーズに結合した状態で回収される。
  6. 磁気ビーズからRNAを回収する。

＊1 キットに含まれていません。別途ご用意下さい。


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製品ラインナップ

製品名をクリックすると該当箇所にページ内ジャンプし、商品コードをクリックすると価格表をご覧になれます。また、「ワークフロー概要」の画像をクリックすると拡大表示されます。

製品名 ALL-IN-ONE
RiboLace Gel Free Kit		 ALL-IN-ONE
RiboLace Pro Kit
RiboLace Pro Kit
RiboLace Starter Kit
商品コード GF001-12 RS0XL-12 RL00P-12 RL00S-04
反応数 12回 12回 12回 4回（0.9 AUで使用の場合）
1反応あたりの
試料量		 0.9 AU 0.9 AU 0.9 AU 0.3～1.2 AU
RPF（Ribosome protected fragment）分離用の試薬 キットに含まれる キットに含まれる キットに含まれる キットに含まれる
ライブラリー
調製用の試薬		 キットに含まれる
・LACEseq（改良版）
・UDI plate		 キットに含まれる
・PAGExt
・LACEseq
・UDI plate		 キットに含まれない キットに含まれない
別途、PAGExt、LACEseq、UDI plateと組み合わせることで、ライブラリー調製を行うこともできる。
用途 リボソームプロファイリング（Ribo-Seq） リボソームプロファイリング（Ribo-Seq） 分離したRPFのRNA-seq以外の解析 実験条件検討、またはリボソームプロファイリング（Ribo-Seq）
製品選択について
  • RNA-seqでの解析を目的とする場合、最もお勧め。
  • PAGE精製の工程がない、堅牢なシステム。
  • 操作にPAGE精製を含むため、ALL-IN-ONE RiboLace Gel Free Kit（左記）よりも操作時間が長く、工程も複雑。
  • 従来製品を継続的にご使用の方へお勧め。
  • ライブラリー調製の試薬を含まないため、RNA-seq以外の解析時に推奨。
  • RiboLace Pro Kit（左記）と異なり、試料量を0.3～1.2 AUの間で自由に設定することができる。
  • 翻訳効率が未知な試料における、プルダウン条件の検討や、試料の溶解条件の検討に使用できる。
  • キットに含まれる試薬は、標準試料（0.9 AU）で４反応分、翻訳効率が高い試料（0.3 AU）で12反応分、初代細胞や神経細胞など翻訳効率が低い試料（1.2 AU）で3反応分となる。
ワークフロー概要 ALL-IN-ONE RiboLace Gel Free Kitの操作方法概略 ALL-IN-ONE RiboLace Pro Kitの操作方法概略 RiboLace Pro Kitの操作方法概略 RiboLace Starter Kitの操作方法概略

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シリーズ共通の特長

  • in vitro、in vivoのいずれでも少量の試料から迅速かつ確実に調製できます。
  • 活性型リボソーム中でのmRNAの位置情報をヌクレオチドレベルの解像度で得られます。
  • 正確に翻訳レベルを推定し、それによりタンパク質量を予測できます。
  • 真核生物の初代培養細胞株、不死化細胞株および組織試料＊2で使用できます。
  • 必要な試料量は、試料の種類と翻訳状態によって異なりますが、1反応あたりおおよそ500,000～1,000,000細胞です。翻訳レベルが非常に高い試料では、300,000細胞まで減らすことも可能です。

＊2 組織試料の調製には、別売のTissue Lysis Buffer（#IBT0032）が必要です。


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All-IN-ONE RiboLace Gel Free Kit

ALL-IN-ONE RiboLace Gel Free Kitは、RPFを単離するためRiboLaceテクノロジーと、効率的で正確な低分子RNA断片のNGSライブラリーを調製するためのLaceSeqテクノロジーを組み合わせたRiboSeq用のフルキットです。この2つの技術の相乗効果により、高速でシンプルかつ堅牢なワークフローが実現します。RPFの単離は1日、ワークフロー全体は2～4日で完了します。PAGE精製や超遠心分離のような複雑な操作を必要としません。

All-IN-ONE RiboLace Gel Free Kitの使用例

A）総リード数に対するリード長の分布

総リード数に対するリード長の分布

RPF（Ribosome protected fragment）の長さは一般的に30～40 ntの間であるが、得られた結果でも30～40 ntの部位が最も高い割合であった。また、60～80 nt付近に小さなピークが見られるが、これは近接した2つのリボソーム（disomes）に由来すると考えられる。


B）リードの領域分布

リードの領域分布

5′UTR、コード配列（CDS）、および3′UTRにマッピングされたリードの割合を示している。


C）各リーディングフレームにおけるP-siteの割合

各リーディングフレームにおけるP-siteの割合

5′UTR、CDS、3′UTRごとに各リーディングフレーム（0, 1, 2）に対応するP-siteの割合を、リードの長さで階層化して示している。パーセンテージはリードの総数で正規化している。
タンパク質が産生される際に基本的にリボソームはRNA上を移動しており、ペプチド鎖に新しいアミノ酸を付加するためには、リボソームのP-site（フレーム0）に正しいアミノ酸を運搬しているtRNAがなければならない。このプロットは、実際にP-site上にあるリードの数、つまりタンパク質を産生するための正しいフレームにあるリードの数を示している。


D）P-siteの位置についてのメタプロファイルプロット

P-siteの位置についてのメタプロファイルプロット

翻訳開始部位（左側の赤い点線）と翻訳終結部位（右側の赤い点線）周辺の全転写産物のP-site位置を示している。
C）のプロットから得られたフレーム0のリードを用いて、3 ntの周期性メタプロファイルプロットを作成した。これは、アミノ酸をコードするためのトリプレットの長さである3 ntずつリボソームが転写産物上を移動するためである。


E）コドン使用頻度プロット

コドン使用頻度プロット

各コドン（正しくコードされたアミノ酸）に関連するコード配列に沿ったフレーム内P-site（フレーム0プロットC）の頻度を示している。


F）カバー率プロット

カバー率プロット

すべての転写産物（各列）について、少なくとも1つのリードがその全長をカバーしている割合を示している。濃い赤（100％）は転写産物の全長がリードでカバーされていることを意味し、黄色（50％）は転写産物の半分についてリードが存在するが、残りの半分はリードが存在しないことを意味する。


G）特定の転写産物におけるリードマッピング

特定の転写産物におけるリードマッピング

画像中に記された転写産物（ENSMUST00000031314）にマッピングされたすべてのリードが示されている。いくつかの領域は他の領域よりも多くのリードを表示しているが、全体としては転写産物の大部分はリードでカバーされている（各位置に少なくとも1つ）。


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ALL-IN-ONE RiboLace Pro Kit

ALL-IN-ONE RiboLace Pro Kitは、RPFを単離するためRiboLaceテクノロジーと、PAGE精製を行うPAGExtテクノロジーおよび効率的で正確な低分子RNA断片のNGSライブラリーを調製するためのLaceSeqテクノロジーを組み合わせた完全なRiboSeq用のフルキットです。PAGE精製の操作を含みますが、超遠心分離操作は不要です。

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解析用ソフトについて

IMMAGINA社では、NGSのシークエンスで得られたデータの解析に、「R」ベースでP-site解析に専用化させたriboWaltzというソフトを使用しています。

■ 原著論文
"riboWaltz: Optimization of ribosome P-site positioning in ribosome profiling data."
Lauria, F., et al., PLoS Comput. Biol., 14 (8), e1006169 (2018). [PMID:30102689]


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キット内容

クリックで展開します
製品名 ALL-IN-ONE
RiboLace
Gel Free Kit		 ALL-IN-ONE
RiboLace
Pro Kit
RiboLace
Pro Kit
RiboLace
Starter Kit
商品コード GF001-12 RS0XL-12 RL00P-12 RL00S-04
Lysis buffer (LB) ● ● ● ●
B-buffer (BB) ● ● ● ●
RiboLace magnetic beads (RmB) v2-1 ● ● － －
RiboLace magnetic beads (RmB) v2-0 － － ● ●
OH-buffer (OH) ● ● ● ●
mPEG ● ● ● ●
RiboLace smart probe (RsP) ● ● ● ●
W-buffer (WB) ● ● ● ●
Nuclease (Nux) ● ● ● ●
Nux enhancer (NE) ● ● ● ●
Proteinase K － ● ● ●
SDS － ● ● ●
25-35 Marker (25-35 M) － ● ● ●
Marker 1 (M1) － ● － －
Marker 2 (M2) － ● － －
Filter tube － ● － －
Pierced tube － ● － －
RNA extraction buffer (REB) － ● － －
DNA extraction buffer (DEB) － ● － －
TR buffer (TR) ● ● － －
G1F buffer (G1F) ● － － －
Buffer BL1 (BL1) ● ● － －
Buffer L2 (BL2) ● ● － －
Buffer L3 (BL3) ● ● － －
Buffer L4 (BL4) ● ● － －
L1 enzyme (L1) ● ● － －
L2 enzyme (L2) ● ● － －
L3 enzyme (L3) ● ● － －
L4 enzyme (L4) ● ● － －
L5 enzyme (L5) ● ● － －
AR enzyme (AR) ● － － －
ATP (1 mM) ● － － －
ATP (10 mM) ● ● － －
GTP ● ● － －
dNTPs ● ● － －
DTT ● ● － －
MnCl2 ● ● － －
PEG 8000 (PEG) ● ● － －
Linker MC+ (MC+) ● － － －
Linker MC (MC) － ● － －
Primer L4 (PL4) ● － － －
Primer RT_T (RT_T) － ● － －
Fw PCR1 (F1) ● ● － －
Rev PCR1 (R1) ● ● － －
3P-RNA (RNA) ● ● － －
iUDIs plate ● ● － －

※ チューブ用マグネットスタンドや各種試薬類は、キットに含まれていません。製品マニュアルをご確認の上、別途ご用意下さい。また、各種操作後のRNA精製には、RNA Clean & Concentrator-5 Kit（Zymo Research社）のご使用をお勧めします。


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RiboLace Kitシリーズ製品の価格

[在庫・価格 ：2024年07月27日 10時55分現在]

※ 表示されている納期は弊社に在庫が無く、取り寄せた場合の納期目安となります。
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 納期 文献数
ALL-IN-ONE RiboLace Gel Free
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リボソームプロファイリング（Ribo-Seq）用の試料分離・ライブラリー調製キット。リボソームに結合して翻訳を阻害する独自のピューロマイシン含有分子が結合した磁気ビーズによるプルダウン法を用いて、抗体やタグ配列を用いずに活性型リボソームのみを分離できる。PAGE精製や超遠心のような複雑な操作を必要としない。12回分。
法規制等
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All-IN-ONE RiboLace Pro
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リボソームプロファイリング（Ribo-Seq）用の試料分離・ライブラリー調製キット。リボソームに結合して翻訳を阻害する独自のピューロマイシン含有分子が結合した磁気ビーズによるプルダウン法を用いて、抗体やタグ配列を用いずに活性型リボソームのみを分離できる。PAGE精製操作を行う。12回分。
法規制等
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RiboLace Pro
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リボソームに結合して翻訳を阻害する独自のピューロマイシン含有分子が結合した磁気ビーズによるプルダウン法を用いて、抗体やタグ配列を用いずに活性型リボソームのみを分離できる。RNA-seq以外の手法で解析する場合に有用。12回分。
法規制等
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RiboLace Starter
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リボソームプロファイリング（Ribo-Seq）用の試料分離キット。リボソームに結合して翻訳を阻害する独自のピューロマイシン含有分子が結合した磁気ビーズによるプルダウン法を用いて、抗体やタグ配列を用いずに活性型リボソームのみを分離できる。翻訳効率が不明な試料での条件検討に有用。4回分（0.9AUの試料を用いた場合）。※NGSライブラリー調製キットが別途必要。
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保存条件 4℃,-20℃,-80℃ 法規備考
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ALL-IN-ONE RiboLace Gel Free

文献数： 0

説明文 リボソームプロファイリング（Ribo-Seq）用の試料分離・ライブラリー調製キット。リボソームに結合して翻訳を阻害する独自のピューロマイシン含有分子が結合した磁気ビーズによるプルダウン法を用いて、抗体やタグ配列を用いずに活性型リボソームのみを分離できる。PAGE精製や超遠心のような複雑な操作を必要としない。12回分。
法規制等
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All-IN-ONE RiboLace Pro

文献数： 0

説明文 リボソームプロファイリング（Ribo-Seq）用の試料分離・ライブラリー調製キット。リボソームに結合して翻訳を阻害する独自のピューロマイシン含有分子が結合した磁気ビーズによるプルダウン法を用いて、抗体やタグ配列を用いずに活性型リボソームのみを分離できる。PAGE精製操作を行う。12回分。
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RiboLace Pro

文献数： 0

説明文 リボソームに結合して翻訳を阻害する独自のピューロマイシン含有分子が結合した磁気ビーズによるプルダウン法を用いて、抗体やタグ配列を用いずに活性型リボソームのみを分離できる。RNA-seq以外の手法で解析する場合に有用。12回分。
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RiboLace Starter

文献数： 0

説明文 リボソームプロファイリング（Ribo-Seq）用の試料分離キット。リボソームに結合して翻訳を阻害する独自のピューロマイシン含有分子が結合した磁気ビーズによるプルダウン法を用いて、抗体やタグ配列を用いずに活性型リボソームのみを分離できる。翻訳効率が不明な試料での条件検討に有用。4回分（0.9AUの試料を用いた場合）。※NGSライブラリー調製キットが別途必要。
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関連製品：PAGExt:PAGE Extraction Kit

迅速かつ高効率に、RNA断片および調製したNGSライブラリー（DNA）のPAGEゲル断片抽出を行うキットです。
キットには、RNA精製12回、DNA精製12回の合計24回の核酸精製を行える試薬およびチューブが含まれています。また、RNA精製（15% TBE-Ureaポリアクリルアミドゲル）、DNA精製（10% TBEポリアクリルアミドゲル）それぞれの電気泳動時に用いる分子量マーカーが含まれています。

PAGExt:PAGE Extraction Kitのキット内容

  • Filter tube
  • Pierced tube
  • RNA extraction buffer (REB)
  • DNA extraction buffer (DEB)
  • 25-35 Marker (25-35 M)
  • Marker 1, 2 (M1, M2)
  • TR buffer (TR)

PAGExt:PAGE Extraction Kitの価格

[在庫・価格 ：2024年07月27日 10時55分現在]

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PAGExt
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RiboLace Pro / Strater KitおよびLACEseq Kitを用いてリボソームプロファイリング（Ribo-Seq）を行う際に，RNA断片および調製したNGSライブラリー（DNA）のPAGEゲル断片抽出を迅速かつ高効率に行うキット。各12回分。
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[在庫・価格 ：2024年07月27日 10時55分現在]

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PAGExt

文献数： 0

説明文 RiboLace Pro / Strater KitおよびLACEseq Kitを用いてリボソームプロファイリング（Ribo-Seq）を行う際に，RNA断片および調製したNGSライブラリー（DNA）のPAGEゲル断片抽出を迅速かつ高効率に行うキット。各12回分。
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関連製品：LACEseq Kit

RiboLace Kitなどで分離したRPF（Ribosome protected fragment）から、高品質のIlluminaライブラリー調製を迅速に行うキットです。

LACEseq Kitの特長

  • 標準的なRibo-seq法（Ingolia et al., 2012）に比べて、わずか20分の1の細胞数から解析を行えます。
  • アクティブなリボソームから、真にRNaseⅠにより切断されたRNA断片のみからライブラリーを調製するため、従来法に比べて、精度が向上しています。
  • rRNAのコンタミネーションを低減します。
  • Ribo-seq解析時に、必要とするシークエンス深度が低減されています。
  • ワークフローの改善により、高品質なライブラリーを2日間で迅速に作成可能です。
  • RiboLace Kitシリーズで分離したRPFの他に、ショ糖密度勾配遠心、ショ糖クッション法、サイズ分画カラムなどで調製したRPFも試料として使用できます。
  • 必要RNA試料量：PAGEゲル断片抽出後に定量化したRPF（Ribosome protected fragment）を5 ng以上
  • 試料RNAの純度：高純度かつ完全な断片を推奨

LACEseq Kitの操作法概略

操作は、RPFのリン酸化、アダプターのライゲーション、RNA鎖の環状化、逆転写、2回のPCRの、合計6つのステップで構成されています。最終的なライブラリーのフラグメント長は220 ntで、Illumina社のアダプターとインデックス配列が組み込まれます。

LACEseq Kitの操作法概略

LACEseq Kitのキット内容

  • ATP
  • GTP
  • dNTPs
  • DTT
  • MnCl2
  • Buffer BL1 (BL1)
  • Buffer L2 (BL2)
  • Buffer L3 (BL3)
  • Buffer L4 (BL4)
  • TR buffer (TR)
  • L1 enzyme (L1)
  • L2 enzyme (L2)
  • L3 enzyme (L3)
  • L4 enzyme (L4)
  • L5 enzyme (L5)
  • Linker MC (MC)
  • Primer RT_T (RT_T)
  • Fw PCR1 (F1)
  • Rev PCR1 (R1)
  • 3P-RNA (RNA)
  • PEG 8000 (PEG)

※ チューブ用マグネットスタンドや各種試薬類は、キットに含まれていません。製品マニュアルをご確認の上、別途ご用意下さい。また、各種操作後のRNA精製には、RNA Clean & Concentrator-5 Kit（Zymo Research社）のご使用をお勧めします。


LACEseq Kitの価格

[在庫・価格 ：2024年07月27日 10時55分現在]

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LACEseq
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リボソームプロファイリング（Ribo-Seq）において，RiboLace Strater Kitなどで単離したRPFから，Illuminaライブラリーを調製するキット。12回分。
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[在庫・価格 ：2024年07月27日 10時55分現在]

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LACEseq

文献数： 0

説明文 リボソームプロファイリング（Ribo-Seq）において，RiboLace Strater Kitなどで単離したRPFから，Illuminaライブラリーを調製するキット。12回分。
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関連製品：iUDIs_adaptor plate

LACEseq Kitを用いてのNGSライブラリー調製時に、TruSeqテクノロジー（Illumina社）に互換なライブラリーを増幅するための、ユニークなデュアルインデックスのPCRプライマーがセットされたプレートです。

iUDIs_adaptor plateの価格

[在庫・価格 ：2024年07月27日 10時55分現在]

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 納期 文献数
iUDIs_adaptor plate
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LACEseq Kitを用いてのNGSライブラリー調製時に，TruSeqテクノロジー（Illumina社）に互換なライブラリを増幅するためのデュアルインデックスのPCRプライマー。
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[在庫・価格 ：2024年07月27日 10時55分現在]

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iUDIs_adaptor plate

文献数： 0

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説明文 LACEseq Kitを用いてのNGSライブラリー調製時に，TruSeqテクノロジー（Illumina社）に互換なライブラリを増幅するためのデュアルインデックスのPCRプライマー。
法規制等
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別売品：Tissue Lysis Buffer

組織試料からの調製を行う場合、本製品で溶解を行って下さい。

Tissue Lysis Bufferの価格

[在庫・価格 ：2024年07月27日 10時55分現在]

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Tissue Lysis Buffer
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説明文
RiboLace Kitシリーズを用いてリボソームプロファイリング（Ribo-Seq）を行う際に，組織試料を溶解するためのバッファー。
法規制等
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[在庫・価格 ：2024年07月27日 10時55分現在]

※ 表示されている納期は弊社に在庫が無く、取り寄せた場合の納期目安となります。

Tissue Lysis Buffer

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説明文 RiboLace Kitシリーズを用いてリボソームプロファイリング（Ribo-Seq）を行う際に，組織試料を溶解するためのバッファー。
法規制等
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Immagina BioTechnology社のリボソーム解析用製品について

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※ AHARIBO Kitの詳細についてはこちらをご覧下さい。


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お問い合わせ先

（テクニカルサポート 試薬担当）

reagent@funakoshi.co.jp

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