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RiboLace Kit / LACEseq Kit
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RiboLace Kit / LACEseq Kit
Ribo-Seqに適した活性型リボソームを分離・ライブラリー調製するキット RiboLace Kit / LACEseq Kit
掲載日情報:2022/10/27 現在Webページ番号:68814
リボソームの機能解析法であるリボソームプロファイリング(Ribo-Seq)用の試料分離・ライブラリー調製キットです。リボソームに結合して翻訳を阻害する独自のピューロマイシン含有分子が結合した磁気ビーズによるプルダウン法を用いて、抗体やタグ配列を用いずに活性型リボソームのみを分離できます。
RPF(Ribosome protected fragment)分離用のRiboLace Kit(#RL001_Mod.1_12または#RL001_XL)と、分離したRPFからのIlluminaライブラリー調製用のLACEseq Kit(#LS001_12)、および関連製品があります(詳細は下記「操作全体の流れ」および「製品ラインナップ」をご覧下さい)。
※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。
追加しました。
- 操作全体の流れ
- 製品ラインナップ
- 使用例
- RiboLace Kit(Module 1 / XL Kit)
- PAGExt:PAGE Extraction Kit
- LACEseq Kit
- iUDI Plate LACEseq
- Riboseq All-in-one Set
- 各キットのFAQ
- Memo:Immagina BioTechnology社のリボソーム解析用製品群について
- 関連した特集記事
操作全体の流れ
※ 画像中の数字は、下記「製品ラインナップ」に対応しています。
参考文献
"Active Ribosome Profiling with RiboLace.",
Clamer, et al., Cell. Rep., 25 (4), 1097~1108.e5 (2018). [PMID:30355487]
追加しました。
製品ラインナップ
製品名をクリックすると該当箇所へページ内ジャンプし、商品コードをクリックすると価格表をご覧になれます。
※ 表中の数字は、上記「操作全体の流れ」に対応しています。
ステップ | 製品名(商品コード) | セット製品 Riboseq All in One Set*1 | ||
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Set (#RS-001s_12) |
Set XL (#RS-012XLs) | |||
① RPF (Ribosome protected fragment) 分離 |
通常の試料 | RiboLace Kit Module 1 (#RL001_Mod.1_12) | ● | - |
翻訳活性が 低い試料 |
RiboLace XL Kit (#RL001_XL) | - | ● | |
ライブラリー 調製 |
② PAGE精製 | PAGExt:PAGE Gel Extraction Kit (#KGE-002_12) | ● | ● |
③ ライブラリー 調製キット |
LACEseq Kit (#LS001_12) | ● | ● | |
③ インデックス 配列の付加 |
iUDI Plate LACEseq (Z1-12:#LS-UDI-012Z1-12、Z13-24:#LS-UDI-012Z13-24、 Z25-36:#LS-UDI-012Z25-36、Z37-48:#LS-UDI-012Z37-48)*1 |
● | ● |
*1 Riboseq All in One Set(#RS-001s_12および#RS-012XLs)には、iUDI Plate LACEseqについてZ1-12、Z13-24、Z25-36、Z37-48のうちの1点がランダムに含まれます。特定のプライマーセットをご希望の場合は、当社テクニカルサポート(試薬担当)までお問合せ下さい。
追加しました。
使用例
細胞試料からRiboLace Kit Module 1を用いてRPF(Ribosome protected fragmen)を分離した後、LACEseq Kitでライブラリーを調製して、NGS解析を行った。
A)RPFの長さの分布
B)P-siteを同定後、開始コドンと終止コドン周辺のRPF長ごとのリードの蓄積をメタヒートマップで示した。シークエスはNovaSeq6000で行った。
C)LACEseqにより得られた、mRNAの5’UTR、コード領域(CDS)、3’UTRそれぞれのP-siteマッピングの割合を示した。右側は、mRNAのそれぞれの領域の長さの割合を示した。
D)得られた翻訳開始点(TIS)および翻訳終了点(TTS)周辺のP-siteの密度を示すメタ遺伝子プロファイル。
PCRのduplicateは、他の市販のsmall RNA sequencingキットで得られたデータや、Ingoliaらが2012に報告したデータと同等であった。
追加しました。
RiboLace Kit(Module 1 / XL Kit)
RPF(Ribosome protected fragment)分離を行うキットです。リボソームに結合して翻訳を阻害する独自のピューロマイシン含有分子が結合した磁性ビーズによるプルダウン法を用いて、抗体やタグ配列を用いずに活性型リボソームのみを分離できます。
通常の組織・細胞試料用のModule 1(#RL001_Mod.1_12)と、翻訳速度が遅く検出が困難な組織・細胞試料用のXL Kit(#RL001_XL)があります(「Module 1とXL Kitの選択について」参照)。
※ RiboLace KitのFAQについてはこちらをご覧下さい。
RiboLace Kitの特長
- in vitro、in vivoのいずれでも少量の試料から迅速かつ確実に調製できます。
- 活性型リボソーム中でのmRNAの位置情報をヌクレオチドレベルの解像度で得られます。
- 正確に翻訳レベルを推定し、それによりタンパク質量を予測できます。
RiboLace Kitの操作方法概略
Module 1とXL Kitの選択について
- Module 1(#RL001_Mod.1_12):通常の組織・細胞試料用
- XL Kit(#RL001_XL):翻訳速度が遅く検出が困難な組織・細胞用(初代細胞や神経細胞など)
本実験の成功は、試料中におけるタンパク質の翻訳状態に強く影響されます。260 nm吸光度(AU)の値が等しくて、同程度の濃度と思われる2つのライセートでも、タンパク質合成の効率が異なることにより、翻訳中のリボソームの量が異なる場合があります。
例えば、不死化細胞は初代細胞よりも翻訳速度が速いことが知られています。また、薬剤やトランスフェクション試薬などの処理がリボソーム活性に影響を与える可能性もあります。このようにRiboLace Kitを用いて実験を行う際には、各試料におけるタンパク質合成の効率を考慮に入れる必要があります。
XL Kitにはキット内容としてPositive control pelletが含まれており、これを溶解とプルダウン効率の基準とすることにより、細胞の種類やタンパク質合成の効率に応じて、1回のプルダウンに使用する試薬の量を微調整することが可能です。
また、用いる試料ライセートの260 nm吸光度(AU)について、Module 1が0.1~0.3 total AUに最適化されているのに対して、XL Kitは0.4~0.9 total AUに最適化されており、XL Kitはより多量の試料ライセートを用いることができます。
RiboLace Kitのキット内容
※ チューブ用マグネットスタンドや各種酵素類は、キットに含まれていません。製品マニュアルをご確認の上、別途ご用意下さい。
RiboLace Kitの価格
[在庫・価格 :2024年03月29日 00時00分現在]
詳細 | 商品名 |
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文献数 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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RiboLace Kit Module 1(12 reactions) |
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0 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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RiboLace XL Kit(12 reactions) |
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0 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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[在庫・価格 :2024年03月29日 00時00分現在]
RiboLace Kit Module 1(12 reactions)
文献数: 0
- 商品コード:RL001_Mod.1_12
- メーカー:IBT
- 包装:1kit
- 価格:ご照会ください
- 在庫:無(未発注)
- 納期:3~4週間 ※※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。
- 法規制等:
説明文 |
リボソームプロファイリング(Ribo-Seq)におけるRPF (Ribosome protected fragment)分離を行うキット。通常の試料用。Illuminaライブラリー調製用キットのLACEseq Kitと組み合わせて用いる。 |
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法規制等 | |||
保存条件 | 4℃,-20℃,-80℃ | 法規備考 | |
掲載カタログ |
ニュース2022年12月1日号 p.10
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製品記事 |
次世代シークエンス(NGS)関連製品特集 |
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関連記事 |
RiboLace XL Kit(12 reactions)
文献数: 0
- 商品コード:RL001_XL
- メーカー:IBT
- 包装:1kit
- 価格:ご照会ください
- 在庫:無(未発注)
- 納期:3~4週間 ※※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。
- 法規制等:
説明文 |
リボソームプロファイリング(Ribo-Seq)におけるRPF (Ribosome protected fragment)分離を行うキット。翻訳活性が低い試料用。Illuminaライブラリー調製用キットのLACEseq Kitと組み合わせて用いる。 |
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法規制等 | |||
保存条件 | 4℃,-20℃,-80℃ | 法規備考 | |
掲載カタログ |
ニュース2022年12月1日号 p.10
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製品記事 |
次世代シークエンス(NGS)関連製品特集 |
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追加しました。
PAGExt:PAGE Extraction Kit
迅速かつ高効率に、RNA断片および調製したNGSライブラリー(DNA)のPAGEゲル断片抽出を行うキットです。
キットには、RNA精製12回、DNA精製12回の合計24回の核酸精製を行える試薬およびチューブが含まれています。また、RNA精製(15% TBE-Ureaポリアクリルアミドゲル)、DNA精製(10% TBEポリアクリルアミドゲル)それぞれの電気泳動時に用いる分子量マーカーが含まれています。
※ PAGExt:PAGE Extraction KitのFAQについてはこちらをご覧下さい。
PAGExt:PAGE Extraction Kitのキット内容
PAGExt:PAGE Extraction Kitの価格
[在庫・価格 :2024年03月29日 00時00分現在]
詳細 | 商品名 |
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文献数 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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PAGExt:PAGE Gel Extraction Kit(24 reactions) |
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0 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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[在庫・価格 :2024年03月29日 00時00分現在]
PAGExt:PAGE Gel Extraction Kit(24 reactions)
文献数: 0
- 商品コード:KGE-002_12
- メーカー:IBT
- 包装:1kit
- 価格:¥130,000
- 在庫:無(未発注)
- 納期:3~4週間 ※※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。
- 法規制等:
説明文 |
RiboLace KitシリーズおよびLACEseq Kitを用いてリボソームプロファイリング(Ribo-Seq)を行う際に,RNA断片および調製したNGSライブラリー(DNA)のPAGEゲル断片抽出を迅速かつ高効率に行うキット。 |
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法規制等 | |||
保存条件 | 4℃,-20℃ | 法規備考 | |
掲載カタログ |
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製品記事 |
次世代シークエンス(NGS)関連製品特集 |
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追加しました。
LACEseq Kit
RiboLace Kit (Module 1 / XL Kit)などで分離したRPF(Ribosome protected fragment)から、高品質のIlluminaライブラリー調製を迅速に行うキットです。
※ LACEseq KitのFAQについてはこちらをご覧下さい。
LACEseq Kitの特長
- 標準的なRibo-seq法(Ingolia et al., 2012)に比べて、わずか20分の1の細胞数から解析を行えます。
- アクティブなリボソームから、真にRNaseⅠにより切断されたRNA断片のみからライブラリーを調製するため、従来法に比べて、精度が向上しています。
- rRNAのコンタミネーションを低減します。
- Ribo-seq解析時に、必要とするシークエンス深度が低減されています。
- ワークフローの改善により、高品質なライブラリーを2日間で迅速に作成可能です。
- RiboLace Kit (Module 1 / XL Kit)で分離したRPFの他に、ショ糖密度勾配遠心、ショ糖クッション法、サイズ分画カラムなどで調製したRPFも試料として使用できます。
- 必要RNA試料量:PAGEゲル断片抽出後に定量化したRPF(Ribosome protected fragment)を5 ng以上
- 試料RNAの純度:高純度かつ完全な断片を推奨
LACEseq Kitの操作法概略
操作は、RPFのリン酸化、アダプターのライゲーション、RNA鎖の環状化、逆転写、2回のPCRの、合計6つのステップで構成されています。最終的なライブラリーのフラグメント長は220 ntで、Illumina社のアダプターとインデックス配列が組み込まれます。
解析用ソフトについて
IMMAGINA社では、NGSのシークエンスで得られたデータの解析に、「R」ベースでP-site解析に専用化させたRiboWaltzというソフトを使用しています。
■ 原著論文
"riboWaltz: Optimization of ribosome P-site positioning in ribosome profiling data."
Lauria, F., et al., PLoS Comput. Biol., 14 (8), e1006169 (2018). [PMID:30102689]
LACEseq Kitのキット内容
※ チューブ用マグネットスタンドや各種試薬類は、キットに含まれていません。製品マニュアルをご確認の上、別途ご用意下さい。また、各種操作後のRNA精製には、RNA Clean & Concentrator-5 Kit(Zymo Research社)のご使用をお勧めします。
LACEseq Kitの価格
[在庫・価格 :2024年03月29日 00時00分現在]
詳細 | 商品名 |
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文献数 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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LACEseq Kit(12 reactions) |
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[在庫・価格 :2024年03月29日 00時00分現在]
LACEseq Kit(12 reactions)
文献数: 0
- 商品コード:LS001_12
- メーカー:IBT
- 包装:1kit
- 価格:ご照会ください
- 在庫:無(未発注)
- 納期:3~4週間 ※※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。
- 法規制等:
説明文 |
リボソームプロファイリング(Ribo-Seq)において,RiboLace Kitなどで単離したRPFから,Illuminaライブラリーを調製するキット。 |
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法規制等 | |||
保存条件 | -20℃,-80℃ | 法規備考 | |
掲載カタログ |
ニュース2022年12月1日号 p.10
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製品記事 |
次世代シークエンス(NGS)関連製品特集 |
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追加しました。
iUDI Plate LACEseq
LACEseq Kitを用いてのNGSライブラリー調製時に、TruSeqテクノロジー(Illumina社)に互換なライブラリーを増幅するための、ユニークなデュアルインデックスのPCRプライマーがセットされたプレートです。インデックス配列が異なる4種類のセットがあります。
iUDI Plate LACEseqの価格
[在庫・価格 :2024年03月29日 00時00分現在]
詳細 | 商品名 |
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文献数 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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iUDI Plate LACEseq set Z1-12 |
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iUDI Plate LACEseq set Z13-24 |
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0 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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iUDI Plate LACEseq set Z25-36 |
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0 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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iUDI Plate LACEseq set Z37-48 |
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0 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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[在庫・価格 :2024年03月29日 00時00分現在]
iUDI Plate LACEseq set Z1-12
文献数: 0
- 商品コード:LS-UDI-012Z1-12
- メーカー:IBT
- 包装:1kit
- 価格:¥98,000
- 在庫:無(未発注)
- 納期:3~4週間 ※※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。
- 法規制等:
説明文 | |||
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法規制等 | |||
保存条件 | -20℃ | 法規備考 | |
掲載カタログ |
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iUDI Plate LACEseq set Z13-24
文献数: 0
- 商品コード:LS-UDI-012Z13-24
- メーカー:IBT
- 包装:1kit
- 価格:¥98,000
- 在庫:無(未発注)
- 納期:3~4週間 ※※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。
- 法規制等:
説明文 | |||
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法規制等 | |||
保存条件 | 法規備考 | ||
掲載カタログ |
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iUDI Plate LACEseq set Z25-36
文献数: 0
- 商品コード:LS-UDI-012Z25-36
- メーカー:IBT
- 包装:1kit
- 価格:¥98,000
- 在庫:無(未発注)
- 納期:3~4週間 ※※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。
- 法規制等:
説明文 | |||
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法規制等 | |||
保存条件 | 法規備考 | ||
掲載カタログ |
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iUDI Plate LACEseq set Z37-48
文献数: 0
- 商品コード:LS-UDI-012Z37-48
- メーカー:IBT
- 包装:1kit
- 価格:¥98,000
- 在庫:無(未発注)
- 納期:3~4週間 ※※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。
- 法規制等:
説明文 | |||
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法規制等 | |||
保存条件 | 法規備考 | ||
掲載カタログ |
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追加しました。
Riboseq All-in-one Set
RPF(Ribosome protected fragment)分離からIlluminaライブラリー調製までに用いる4つの製品(RiboLace Kit Module 1(#RS-001s_12の場合)またはRiboLace XL Kit(#RS-012XLの場合)、PAGExt:PAGE Extraction Kit、LACEseq Kit、iUDI Plate LACESeq)をセットにした製品です。
※ Riboseq All in One Set(#RS-001s_12および#RS-012XLs)には、iUDI Plate LACEseqについてSet Z1-12~Set Z37-48のうちの1点がランダムに含まれます。特定のプライマーセットをご希望の場合は、当社テクニカルサポート(試薬担当)までお問合せ下さい。
Riboseq All-in-one Setの価格
[在庫・価格 :2024年03月29日 00時00分現在]
詳細 | 商品名 |
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文献数 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Riboseq All-In-One set, 12 reactions |
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RiboSeq All-in-one set XL, 12 reactions |
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[在庫・価格 :2024年03月29日 00時00分現在]
Riboseq All-In-One set, 12 reactions
文献数: 0
- 商品コード:RS-001s_12
- メーカー:IBT
- 包装:1kit
- 価格:ご照会ください
- 在庫:無(未発注)
- 納期:3~4週間 ※※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。
- 法規制等:
説明文 |
リボソームプロファイリング(Ribo-Seq)において,RPF (Ribosome protected fragment)分離からIlluminaライブラリー調製までに用いる4つの製品(RiboLace Kit Module 1,PAGExt:PAGE Gel Extraction Kit,LACEseq Kit,iUDI Plate LACEseq)をセットにした製品。 |
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法規制等 | |||
保存条件 | 4℃,-20℃,-80℃ | 法規備考 | |
掲載カタログ |
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RiboSeq All-in-one set XL, 12 reactions
文献数: 0
- 商品コード:RS-012XLs
- メーカー:IBT
- 包装:1kit
- 価格:ご照会ください
- 在庫:無(未発注)
- 納期:3~4週間 ※※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。
- 法規制等:
説明文 |
リボソームプロファイリング(Ribo-Seq)において,RPF(Ribosome protected fragment)分離からIlluminaライブラリー調製までに用いる4つの製品(RiboLace XL Kit,PAGExt:PAGE Gel Extraction Kit,LACEseq Kit,iUDI Plate LACEseq)をセットにした製品。 |
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法規制等 | |||
保存条件 | 4℃,-20℃,-80℃ | 法規備考 | |
掲載カタログ |
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次世代シークエンス(NGS)関連製品特集 |
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追加しました。
各キットのFAQ
Q-1. RiboLaceのプルダウンを行う前に、細胞ペレットをCycloheximideで処理する必要がありますか?
A-1. キット構成品のLysis buffer(LB)およびW-buffer(WB)中には、Cycloheximide(CHX)が含まれています。事前の細胞のCHX処理の有無にかかわらず、RiboLaceはよく機能します。
とはいえ、細胞にCHXを添加するか否かの選択は、ユーザー様の実験系に依存します。
一部のユーザー様からは、CHX添加による開始コドン付近のPサイトの周期性の歪みが報告されています。一方、CHXはRPF(Ribosome protected fragment)の長さを、28ヌクレオチドのより均一なピークにシフトさせます。
我々の経験上、20 μg/mlのCHX添加により、コード領域に沿ったPサイトの分解能の周期性が若干改善されます。しかし、CHX未処理で新鮮な凍結の脳組織試料で、良好なPサイト周期性の結果が得られた例もあります。
試料がリボソームの流出に敏感な場合は、CHX濃度を増やすことをお勧めします。W-buffer(WB、CHX濃度:20 μg/ml)のボトルにCHXストック溶液(10 mg/ml)を30 μl加えて、W-bufferのCHX濃度を40 μg/mlに調製します。
まとめると、ユーザー様の経験に基づいた、ユーザー様の試料に最適なプロトコルを用いることをお勧めします。
Q-2. RiboLaceに用いる試料をどのように凍結すれば良いですか?
A-2. RiboLace実施前の試料保存について、CHXを用いた細胞試料の場合、細胞溶解後、-80℃で最大1~2ケ月までの保存とすることをお勧めします。
CHXを用いていない細胞試料の場合、未溶解の細胞を瞬間凍結し、-80℃で最大1~2ケ月までの保存とすることをお勧めします。
組織試料の場合、瞬間凍結し、-80℃で最大1~2ケ月までの保存とすることをお勧めします。
Q-3. すべての実験操作を1日で終わらせることができません。Step2のBeads Functionalizationが終わった時点で、操作を止めても良いでしょうか?
A-3. はい。Step2で実験操作を止めることができます。その場合、Step2.9のRiboLace smart probeを含む溶液中にビーズを入れておく(つまり、磁力による分離とmPEGによる安定化の前)で止めることをお勧めします。
室温、1,400 rpmで1時間の遠心分離後、ビーズを4℃で一晩保存できますが、その際にビーズを凍結させないで下さい。
Q-4. RPFライブラリーの調製に、市販の少量試料用small RNA-seqライブラリー調製キットを使用できますか。
A-4. はい。RiboLace Kit Module 1とSMARTer smRNA-Seq Kit for Illumina(タカラバイオ社)の組合せについては、社内検証で確認しています。また、ユーザー様の中にはQIAseq miRNA Library Kit(キアゲン社)との組み合わせで、信頼できる結果を得られた方もいらっしゃいます。
一般的に、これらのキットを用いる場合はすべて、LACEseq KitプロトコルのStep1に記載のフラグメントの脱リン酸化をあらかじめ行うことが必要となります。市販のsmall RNA-seqライブラリー調製キットを用いた場合、収量と品質の点で優れたライブラリーを調製できますが、コーディング領域に沿った周期性が少し失われます。
Q-5. どのくらいの量の細胞やRNAを試料として使用できますか?
A-5. RiboLaceは、1×105~3×106個の細胞(70~80%コンフルエント)で良好に機能します。ユーザー様の中には1×104個の細胞でうまくいかれた方もいらっしゃいますが、使用する細胞数は細胞の種類や研究対象となる疾患・病態に大きく依存します。これは、停止したリボソームからのノイズを避けるために、RiboLaceが活発に翻訳しているリボソームのみを分離するからです。
もし、ユーザー様の細胞が翻訳阻害されている場合(例:薬剤、熱ショック処理、または特定の疾患)は、最終的に良い結果を得るためには、おそらくもっと多くの細胞が必要となるでしょう。
Total RNA量でお答えするならば、0.1~2 μgのTotal RNAを推奨します。
Q-6. Module 1のプロトコル中で、0.3 AU(260 nm)に相当するライセートの総量から開始するようにとありますが、この吸光度はどのように計算すればよいのでしょうか?
A-6. Lysis bufferをブランクとして、ライセートをNanoDropで260 nm測定し、この吸光度の値から必要量を計算します。
例えば、ライセートの吸光度(A260)が10を示した場合、10 AU/mlとなり、0.01 AU/μlに相当します。つまり、0.3 AUから始めたい場合は、30 μlが必要です。
Q-7. RiboLace処理する前に、試料を濃縮する方法はありますか?
A-7. Lysis Buffer(LB)の量を0.3 mlから0.05 mlに減らして、細胞溶解を試みることができます。ただし、100 mmディッシュを用いて行き渡るLBの量が少ないと、効率的な細胞溶解ができない可能性があります。この場合は、6ウェルプレートなどの表面積の小さい培養器材に細胞を播種して下さい。
Q-8. どのような生物種に対してRiboLace Kitは使用できますか?
A-8. 一般論として言えば、RiboLaceは真核生物のリボソームで効果を発揮しますが、これまで哺乳類細胞、マウス、昆虫の組織に対して社内で検証されています。また、植物や原核生物での検証実験に取り組んでいます。
Q-9. Step5では、ビーズ懸濁液に酸性フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールを加えれば良いのでしょうか?
A-9. はい。Step4の洗浄ステップの後の時点でも、リボソームはビーズに結合しています。
Q-10. キットの有効期限はどのくらいですか?
A-10. 12ケ月です。
Q-11. PAGEゲル断片抽出を行う際に、ライブラリーの精製のために試料を3レーンに分けることは必須ですか?
A-11. 3レーンに分けることをお勧めするのは、ゲルの解像度を上げ、ライブラリーのバンドカットを向上させるためです。もちろん、2レーンに分けて、ライブラリーのバンドがきちんと分離できるかどうかを試すこともできます。
Q-12. PAGEゲル断片抽出のプロトコル中に、「残ったゲルの破片をpierced tubeから慎重に移す」とあります。これは1.5 mlチューブに移すという意味でしょうか?
A-12. すべての試料を回収するために、残ったゲルの破片は、1.5 mlチューブに移して下さい。
Q-13. PAGEゲル断片抽出のプロトコル中に、「3 rpmで振とうする」とあります。ゆっくり振とうすることが必須なのでしょうか?
A-13. 振とう速度はそれほど重要ではありません。
Q-14. PAGEゲル断片抽出のプロトコル中に、「-80℃で、2時間(fast procedure)またはオーバーナイト(safe procedure)のインキュベーション」とあります。safe procedureのオーバーナイトでのインキュベーションは、どのような場合に用いるのが良いでしょうか?
A-14. ほとんどの場合、2時間で問題ありませんが、ライブラリーの濃度が非常に低い場合は、沈殿を改善するために-80℃でのインキュベーション時間を増やして下さい。
Q-15. どのくらいの量のRNA試料が必要ですか?
A-15. 精製したRibosome Protected Fragment(RPF)が最低5 ng必要です。
通常、1回のRiboLaceプルダウンで5 ngのRPFが得られ、HeLa細胞の場合、これは1×105~1×106個の細胞に相当します。RPFの回収効率は、細胞のタンパク質合成速度に依存します。
ショ糖クッション法やショ糖密度勾配遠心分離を使用する場合は、少なくとも5×106個のHeLa細胞から始める必要があります。
Q-6. LACEseq KitはmiRNAのシークエンスに使用できますか?
A-16. いいえ、miRNAは3'-OH末端を有するため、使用できません。LACEseqでは、3'リン酸末端を持つRNAフラグメントのみを捕捉し、シークエンスに用いることができます。
Q-17. 最初のライゲーション反応では、どのくらいの量のリンカーを使用すれば良いのでしょうか?
A-7. 未発表のデータによると、25~35 ntのフラグメントのうち、実際にヌクレアーゼで生成され、3'リン酸末端を持つRPFは約50%しかないことがわかっています。そこで、リンカーとフラグメントを、1:2のモル比で使用することをお勧めします。
RPF量 | Linker量 (pmol) | モル比 (Linker:RPF) | |
---|---|---|---|
(ng) | (pmol) | ||
10 | 1 | 0.5 | 1:2 |
20 | 2 | 1 | 1:2 |
Q-18. リンカーには、Illuminaのアダプター配列(SP1、SP2、P5、P7)は含まれているのですか?
A-18. いいえ、2回目のPCRで、Illuminaの配列を追加しています。
Q-19. RiboLace Kit (Module 1 / XL Kit)、PAGExt:PAGE Extraction Kit、LACEseq Kit、iUDI plate LACEseqがあれば、リボソームプロファイリングに必要なキットはすべてそろいますか?
A-19. はい、プロトコルに記載されている基本的な実験装置および器具と、いくつかの一般的な試薬があれば大丈夫です。
Q-20. 互換性のあるIllumina indexing primerは何ですか?
A-20. TruSeq Compatible indexing primerまたはIllumina TruSeq HT(現在はTruSeq CD)です。
Q-21. LACEseq用のiUDIプレートには、どのようなインデックス(i5、i7)が含まれていますか?
A-21. Illumina用IDT(8 nt)です。
Q22. RiboLace以外のリボソームプロファイリングプロトコルで作製したRPFにも、LACEseqを使用できますか?
A-22. はい、ライブラリー調製前に試料を脱リン酸化しない限り、使用できます。
Q-23. LACEseqライブラリー調製の前に、T4 PNKによる脱リン酸化を行う必要がありますか?
A-23. いいえ。必要ありません。
Q-24. どのようなシークエンスプラットフォームがLACEseqに適していますか?
A-24. これまでにNovaseq6000、HiSeq2500、NextSeq550、MiSeqでテストしています。
Q-25. お勧めするRiboseqデータの解析ソフトを教えて下さい
A-25. はい、私たちは独自のソフトを持っています。コードはこちらで公開しています
Q-26. キットを初めて使用する際のポジティブコントロール反応について、LACEseqのステップ1から最終的なライブラリーの精製まで使用するべきでしょうか?あるいは、RPFのPAGEゲル断片抽出の前から始めても良いでしょうか?
A-26. ポジティブコントロールは、プロトコルの最後まで使用することができます(キットが正しく動作していることを確認する方法であり、ライブラリーのPAGEゲル断片抽出の際のサイズマーカーとしても有用です)。
ポジティブコントロールはすでに精製されていますので、そのままPK反応を開始することができます。
Q-27. LACEseqのステップ2(ライゲーション)では、RPFとLinker_MCの比率についてコメントがあり、RPFをmiRNA Qubit(Thermo Fisher Scientific社)で定量する必要があると書かれています。これは、ステップ1の精製後に再度定量する必要があるのか、それともPAGEゲル断片抽出後(ステップ1の前)に行った定量に基づいて比率を計算するのでしょうか?
A-27. ここでは最初のRPFsの定量値を使って比率を計算しても構いません。
Q-28. 1回目のPCRの後、AMPURE XP beads(Beckman Coulter社)で精製して40 μlで溶出しますが、2回目のPCRには24μlしか使いません。24μlしか必要ないのに、なぜ40 μlで溶出するのですか?PCR産物の量が多すぎませんか?必要な場合に備えて、残りのPCR産物を保存しておくことはできますか?
A-28. はい、残りのPCR産物は、2回目のPCRを追加で行う時のために取っておくことができます(何か問題が発生したり、ライブラリの濃度を上げる必要がある場合など)。
Q-29. NGS施設の空き状況などにより、NGSシークエンスに1日か2日待たなければならない場合、その間ライブラリーを-80℃に保つべきでしょうか、それともPAGEゲル断片抽出を終えてから最終精製ライブラリーを凍結しても良いでしょうか?後者の場合、-80℃と-20℃のどちらで凍結すべきでしょうか?
A-29. PAGEゲル断片抽出を終了してから、TR bufferで溶出したライブラリーを、シークエンスランの準備ができるまで-20℃で保存することができます。
Q-30. 推奨されたカラーバランスの検証方法がわかりません。また、4つ以上の試料をプールすることは可能でしょうか?最大でどれくらいでしょうか?その場合、どのような組み合わせで使用すれば良いのでしょうか?例えば、1~8のプライマーを使って8つの試料をプールすることは可能でしょうか?
A-30. 試料数の最大値はシークエンス深度によって異なりますが、インデックスを列(column)方向についてはプールすることができます(行(row)をまたいでライブラリーをプールしないで下さい)。
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Memo:Immagina BioTechnology社のリボソーム解析用製品群について
※ AHARIBO Kit およびCircAID-p-seq Kitの詳細については、それぞれ該当のページをご覧下さい。
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