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rRNAを除去したTotal RNAのNGSライブラリー調製キット Zymo-Seq RiboFree Total RNA Library Kit

掲載日情報:2023/07/21 現在Webページ番号:68149

rRNAを除去(枯渇)したTotal RNAのライブラリーを、バイアスなく、正確かつ迅速・簡便に調製できるキットです。RNAライブラリー調製までを行えるTotal RNA Library Kitと、rRNAを除去した一本鎖cDNA調製までを行うUniversal cDNA Kitがあります。
本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。


様々な生物種由来RNAからのrRNAの効率的な除去1
様々な生物種由来RNAからのrRNAの効率的な除去2

様々な生物種由来RNAからのrRNAの効率的な除去
各生物種由来の100 ngのtotal RNAを試料として用い、標準プロトコルの1時間の除去反応の後、ライブラリーを調製し、11サイクルのPCRで増幅した。
STARでアラインメントした各リードについて、Ensemblのアノテーションと、UCSC genome browserのRepeatMasker rRNA tracksに基づいてリードの分類を行った。
様々な生物種由来RNAにおいて、rRNAの効率的な除去、およびタンパク質をコードする転写産物やその他の転写産物を高い割合でカバーしていることが示された。


製品仕様変更のお知らせ

下記製品について、2023年6月中旬より製品仕様が変更されました。
必要な試料量を減らし, 操作時間が短縮された改良版となります。

対象キット名 反応数 商品コード 仕様変更後の
製品マニュアル
仕様変更の
ご案内
Zymo-Seq RiboFree Total RNA Library Kit 12 prepsR3000 pdfマーク pdfマーク
96 prepsR3003
Zymo-Seq RiboFree Universal cDNA Kit 12 prepsR3001 pdfマーク

商品コード、品名の変更はございません。

操作手順・調製方法や推奨のRNA量が変更されています。
詳細は, 上記の仕様変更のご案内、および仕様変更後の製品マニュアルをご確認下さい。
ご不明な点がございましたら、当社テクニカルサポート(試薬担当、下記参照)までお問合せ下さい。



特長

  • Total RNAを抽出した際、大量に含まれるrRNAを除去することにより、転写量が微量のmRNAやnon-coding RNAのリード数を確保したシークエンシングが可能となります。
  • コードRNA・非コードRNA双方を含む*1完全なトランスクリプトームのRNAライブラリーを調製できます。
  • プローブを用いない独自のRiboFree Universal Depletion技術により、すべての生物種のRNAから、rRNAを酵素的に除去します。
  • rRNA除去時のバイアスがなく、正確なRNAライブラリーを調製できます。
  • 両端のアダプターを同時にライゲーションすることができ、操作の手間を軽減します。
  • プロトコルが合理化されており、自動分注装置への適応が可能です。
  • 調製したライブラリーはストランド特異的で、Read1配列は元のRNAに対するアンチセンスになります。
  • 調製したライブラリーは、HiSeq Xを除くIlluminaのすべてのシークエンシングプラットフォームに対応しています。

*1 長鎖非コードRNA(lncRNA)、イントロンRNA、核小体RNA(snoRNA)、および分解されたpoly(A)テールを有するmRNAも含まれます。


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仕様

用いる試料 RNA
用いるRNAの量 10~250 ng:Total RNA Library Kit
10~1,000 ng:Universal cDNA Kit
用いるRNAの品質 A260 / A280 ≧1.8、 A260 / A230 ≧1.8、DNAおよびPCR阻害物質を含まない。
操作時間*2 4~8時間:Total RNA Library Kit(RNA試料からライブラリー調製まで)
~1.75時間:Universal cDNA Kit(RNA試料から一本鎖cDNA調製まで)

*2 用いる試料量により異なります。


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酵素によるrRNA除去の原理

酵素によるrRNA除去(枯渇)は、プローブを必要としません。その代わりにRNAとcDNAのハイブリダイゼーション反応の速度論が関与します。

zymoseq-ribofree原理

  1. 逆転写により形成されたcDNA-RNAハイブリッドを、変性により一本鎖にする。
  2. rRNAのように非常に豊富に存在するRNAは、反応液中の相補的なcDNAと再度ハイブリダイズする可能性が高く、rRNAとcDNAの二本鎖を形成する。
  3. 形成した二本鎖に酵素が結合し、二本鎖からrRNAだけを残してcDNAを分解する。反応が進むにつれて、相補的なcDNAと比較して高濃度のrRNAが存在することになるため、rRNAなどに相補的なcDNAが試料中から枯渇するまで反応はさらに促進される。
  4. 非常に豊富に存在するRNAを酵素により枯渇させると、残ったRNAが目的のRNA集団となる。この反応は分子動力学に依存しているため、反応への投入量が多いほど反応は速く進み、投入量と培養時間の間には逆相関の関係が生じる。

このプローブを使用しない酵素による除去法の利点は、汎用性があり、RNA試料の生物種に応じた製品を個別に購入する必要がなく、1つのキットですべてを行うことができるという点です。非モデル生物を対象とした研究で、従来はその生物特有のプローブパネルを開発する必要があった場合に特に有効です。
酵素による除去法のもう一つの利点は、バイアスの低減です。プローブ法では、プローブに結合するRNAのみが除去されるのに対し、酵素法では、最も豊富に存在するRNAを最初に最も効率的に除去させることができます。


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操作方法概略

Zymo-Seq RiboFree Total RNA Library Kitの操作方法概略

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他社製品との比較

本製品
(Total RNA Library Kit)
A社製品 B社製品 C社製品 D社製品
試料RNAの対応生物種 すべての生物種
(ヒト、マウス、ラット、植物、菌類、バクテリアを含む)
ヒト、マウス、ラット、バクテリア、疫学的試料 ヒト、マウス、ラット ヒト、マウス、ラット ヒト、マウス、ラット
あらゆる生物種に対応 × × × ×
キットの対応範囲 ライブラリー調製まで ライブラリー調製まで ライブラリー調製まで rRNA除去のみ rRNA除去のみ
別途必要な試薬 なし Index Adapter Adapter ライブラリー調製キット ライブラリー調製キット
実操作時間 ~85分 >2時間 >2時間 >2時間 >2時間
全所要時間 4~8時間
(試料量に依存)
~7時間 ~6.5時間 >7時間 ~5時間

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論文に掲載実績のある試料生物種の例

  • ニワトリ
  • 扁形動物
    (ネコ肝吸虫Opisthorchis felineus
  • マツヨイグサ
  • ナズナ
  • マスタードヒルコーラル(ハマサンゴ)
  • バシラス目細菌の胞子
  • Borrelia burgdorferi(ボレリア属)
  • シアノバクテリア(アナベナ属)
  • Listeria monocytogenes(リステリア菌)
  • Mycobacterium tuberculosis(結核菌)
  • Oenococcus oeni(乳酸菌)
  • Pseudomonas fragie(シュードモナス属)

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使用例

異なる試料量でも高い一貫性を示す

異なる試料量でも高い一貫性を示す1
異なる試料量でも高い一貫性を示す2
異なる試料量でも高い一貫性を示す3

10 ngおよび100 ngのUniversal Human Reference RNA(UHRR、RIN>8)にUniversal ERCC Spike-In Controls Mix 1を添加したものを試料として、Zymo-Seq RiboFree Total RNA Library Kitでライブラリー調製を行った。シークエンシング後、GRCh38へのアノテーションを行った。
A:2つのライブラリーのTPM(Transcripts Per Million)相関図。それぞれのライブラリーで>28,900遺伝子が検出され、そのうちの26,400遺伝子が双方で検出された。
B:10 ngのUHRRライブラリーで検出された84のERCC転写産物のTPMと、元の濃度との相関。
C:2つのライブラリー双方で検出された82のERCC転写産物のTPM相関。
すべてのr(ピアソン相関係数)および傾きは、対数変換したTPMまたは濃度で計算した。


劣化したRNA試料からのライブラリー調製も可能

劣化したRNA試料からのライブラリー調製も可能

ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)ヒト組織(RIN=1.6、ピーク<200 nt)から抽出した50 ng、150 ng、250 ngのTotal RNAを用いて、それぞれライブラリーを調製した。
Zymo-Seq RiboFree Total RNA Library Kitを用いれば、分解した試料でも効率的にrRNAを除去できることが示された。


調製したライブラリーの特性

調製したライブラリーの特性

100 ngのUniversal Human Reference RNA(UHRR、RIN>8)を用い、11 index PCRサイクルで増幅によりライブラリー調製した。得られたライブラリーをAgilent 4150 TapeStation D5000で解析した。
Zymo-Seq RiboFree Total RNA Library Kitで調製したライブラリーの平均サイズは~ 560 bpで、アダプターダイマー(~180 bp)は見られない。


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FAQ

Zymo-Seq RiboFree Total RNA Library KitのFAQ

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Q-1. どのような試料が使用できますか?

A-1. あらゆる生物から精製したTotal RNAを使用できます。メーカーWeb、およびApplication Note(但し旧バージョン:ver. 1.3.0についての記載)も併せてご確認下さい。



Q-2. メタトランスクリプトミクス解析に適していますか?

A-2. 本キットはメタトランスクリプトミクス解析用に設計されていないため、それに用いた場合の性能を保証することはできません。
なお、ZymoBIOMICS Microbial Community Standard(#D6300)から抽出したtotal RNAを用いた予備テストでは、100 ngのRNAを試料として使用し、2時間除去させた結果、rRNAリードの残存率が約25%のライブラリーが得られました。この結果から、複雑性の低いメタトランスクリプトーム試料(<10微生物種/株)のrRNA除去には、本キットが適している可能性があり、可能な限り多量のtotal RNAを試料として使用し、オプションとして最低2時間はrRNA除去反応を行うことをお勧めします。詳細は、当社テクニカルサポート(試薬担当、下記参照)までお問合せ下さい。



Q-3. RIN値が低い分解したRNA試料を使用できますか?

A-3. FFPE試料から抽出したRNAなど、RIN値の低い劣化したRNAでも、本キットを用いてライブラリーを調製することは可能ですが、性能に悪影響が出る可能性があります。
劣化した試料を使用して最適な結果を得る方法については、製品マニュアルのAppendix Eに詳細を記載していますので、そちらをご確認下さい。もしくは、当社テクニカルサポート(試薬担当、下記参照)までお問合せ下さい。



Q-4. RNA試料にDNAが混入している場合どうなりますか?

A-4. DNAの混入は、遺伝子発現の定量的測定や発現量差の解析の精度や感度に悪影響を及ぼします。そのため、本キットを用いる前に、RNA試料から混入したDNAを除去することをお勧めします。
抽出したRNAについて、DNaseⅠ処理とその後のクリーンアップを含むRNA Clean & Concentrator-5(#R1013)の使用をお勧めします。このキットについては、本キットでの使用を検証しています。



Q-5. プローブを用いないUniversal rRNA Depletionをどのようにして実現しているのでしょうか?

A-5. 本キットは、試料RNAを鋳型として、高濃度で存在する配列からの逆転写cDNAの除去を促進します。これにより、プローブを使用せず、あらゆる生物のRNAに普遍的に適合するrRNA除去が可能になります。詳細についてはNature誌の記事をご確認下さい。



Q-6. 試料RNAの断片化をどのようにして実現しているのでしょうか?

A-6. 通常、逆転写時のランダムヘキサマーのプライミングと除去時の反応条件により、Illuminaシークエンサー用の適切なサイズのインサートと最終ライブラリーの作製が可能になります。



Q-7. クリーンアップのステップで、どのくらいの時間Select-a-Size MagBeadを風乾すれば良いでしょうか?

A-7. 湿度や温度が研究室によって異なるため具体的な推奨時間では記しませんが、ビーズペレットの濡れによる光沢が乾いてマットな外観になったら、すぐにElution bufferをビーズペレットに加えることをお勧めします。チューブを明るい光にかざすと、この変化をリアルタイムでより簡単に見ることができます。
ビーズペレットがまだ湿っているときや、ペレットが割れた後に溶出バッファーを加えることは、ライブラリー収量の減少につながる可能性があるため避けて下さい。ご参考までに、異なる乾燥レベルを示す画像例を示します。

ビーズペレットの乾燥レベル

乾燥しすぎたビーズ(左)は、乾燥させた泥のように、ひび割れ、薄片状になる。
乾燥中のビーズ(右)は、濡れた泥のように、濡れによる光沢が見られる。
適切に乾燥させたビーズ(中央)は、湿ってはいるが、光沢を失っている。




Q-8. #R3000のキットに含まれるUDI 1-12に加えて、さらに異なるUDI primer setを購入するにはどうすればよいですか?

A-8. UDI indexes 1-96については、96 prepキット(#R3003)にキット構成品として含まれている他、Zymo-Seq UDI Primer Plate(#D3096)として販売をしています。



Q-9. 同じUDI primer setを用いて、複数試料からのライブラリーを調製できますか?

A-9. Zymo-Seq UDI Primer Set(#D3008)の各UDIプライマーセットは、同じUDIセットのライブラリーをプールして同じレーンでシークエンシングしない限り、複数回使用することができます。
UDI primer setの詳細については製品マニュアルのAppendix Bをご確認下さい。もしくは、当社テクニカルサポート(試薬担当、下記参照)までお問合せ下さい。



Q-10. 調製したライブラリーは、どのプラットフォームに対応していますか?ロングリードシークエンシングに対応していますか?

A-10. 本キットで調製したライブラリーは、HiSeq Xを除くIlluminaのすべてのシークエンシングプラットフォームに対応しています。Ion Torrent、Oxford Nanopore、PacBioのプラットフォームには対応していません。



Q-11. rRNA除去操作部分は、他のRNAライブラリー調製キットと組み合わせることはできますか?

A-11. はい。rRNA除去操作部分は、Zymo-Seq RiboFree Universal cDNA Kit(#R3001)という独立した製品として販売しており、一本鎖DNAを試料とするライブラリー調製キットと組み合わせることができます。



Q-12. 製品マニュアルがver. 1.3.0からver. 2.0.0に改良されましたが、手元にあるキットのバージョン確認と、改良内容を知るためにはどうすれば良いですか?

A-12. いずれのバージョンの製品マニュアルを用いるべきかを確認する方法はいくつかあります。
1つはキットに含まれる試薬を確認して下さい。試薬の名称が変更されています。また、改良版には「Depletion reagent 4」という試薬が含まれています。
全体的にver. 1.3.0と比較すると、改良版では、最少試料量が少なくなり(10 ng total RNA)、除去反応時間が短くなり(100 ng試料の場合1時間)、ビーズのクリーンアップの回数が1回少なくなりました。
改良版についてより詳細な説明をご希望の場合や、旧バージョン(ver. 1.3.0)の製品マニュアルの電子ファイルがご入用の場合は、当社テクニカルサポート(試薬担当、下記参照)までお問合せ下さい。



Q-13. 10 ng以下のtotal RNA量でライブラリーを調製できますか?10 ng以下の試料を用いることを補うために、rRNA除去反応をオーバーナイトで行うことはできますか?

A-13. 10 ngより少ない試料量からライブラリーを調製することは可能ですが、性能に悪影響が出る可能性があります。1~9 ngのRNAを用いる場合のプロトコル変更については、製品マニュアルのAppendix Dをご確認下さい。もしくは、当社テクニカルサポート(試薬担当、下記参照)までお問合せ下さい。
なお、rRNA除去反応をオーバーナイトで行うことはお勧めいたしません。



Q-14. 典型的なライブラリーの収量はどのくらいですか?

A-14. ライブラリーの収量は、試料RNAの質や量、ライブラリー増幅の際のPCRサイクル数などの要因によって変化します。一般的に、10 ngのUniversal Human Reference RNA(RIN > 8.0)を試料として、11 PCRサイクルで増幅し、20 μlのDNA elution bufferに溶出すると、ライブラリー収量は10 nmol/Lを超えます。



Zymo-Seq RiboFree Universal cDNA KitのFAQ

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Q-1. このキットで得られるものはRNAですか?

A-1. いいえ。最終産物は一本鎖cDNAです。



Q-2. このキットはライブラリー調製キットの一部分ですか?

A-2. はい。本製品はZymo-Seq RiboFree Total RNA Library Kitに含まれています。



Q-3. 他のRNAライブラリー調製キットと組み合わせることはできますか?

A-3. はい。一本鎖DNAを試料とするあらゆるライブラリー調製キットと組み合わせることができます。



Q-4. 原核生物由来RNAを使えますか?

A-4. はい。あらゆる生物由来RNAに使用できます。



Q-5. 10 ng以下のtotal RNA量で使用できますか?

A-5. 10 ngより少ない試料量からNGSグレードのcDNAを調製することは可能ですが、性能に悪影響が出る可能性があります。1~9 ngのRNAを用いる場合のプロトコル変更については、製品マニュアルのAppendix Bをご確認下さい。もしくは、当社テクニカルサポート(試薬担当、下記参照)までお問合せ下さい。



Q-6. 製品マニュアルがver. 1.1.0からver. 2.0.0に改良されましたが、手元にあるキットのバージョン確認と、改良内容を知るためにはどうすれば良いですか?

A-6. いずれのバージョンの製品マニュアルを用いるべきかを確認する方法はいくつかあります。
1つはキットに含まれる試薬を確認して下さい。試薬の名称が変更されています。また、改良版には「Depletion reagent 4」という試薬が含まれています。
全体的にver. 1.1.0と比較すると、改良版では、最少試料量が少なくなり(10 ng total RNA)、除去反応時間が短くなりました(100 ng試料の場合1時間)。
改良版についてより詳細な説明をご希望の場合や、旧バージョン(ver. 1.1.0)の製品マニュアルの電子ファイルがご入用の場合は、当社テクニカルサポート(試薬担当、下記参照)までお問合せ下さい。





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NGS特集へのリンク

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キット内容

各キットコンポーネント名をクリックすると、単品の価格表をご覧いただけます。

キット名 Zymo-Seq RiboFree
Total RNA Library Kit
Zymo-Seq RiboFree
Universal cDNA Kit
(12 preps)
(12 preps) (96 preps)
商品コード R3000 R3003 R3001
cDNA synthesis reagent 1 / 2
Depletion reagent 1~4
Adapter ligation buffer 1~3
Adapter ligation master mix
Amplification PreMix
Zymo-Seq UDI primer set
(Indexes 1-12)
Zymo-Seq UDI primer set
(Indexes 1-96)
Select-a-Size MagBead
Select-a-Size MagBead buffer
Library binding solution
Zymo-Seq wash buffer
DNA elution buffer
DNase / RNase-free water

磁気ビーズスタンドが別途必要です。PCR Strip MagStand(#3DP-1002)のご使用をお勧めします。


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価格

[在庫・価格 :2024年03月29日 00時00分現在]

※ 表示されている納期は弊社に在庫が無く、取り寄せた場合の納期目安となります。
詳細 商品名
  • 商品コード
  • メーカー
  • 包装
  • 価格
  • 在庫
  • 法規制等
納期 文献数
Zymo-Seq RiboFree Total RNA Library Kit (12 preps)
2週間程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 10
説明文
rRNAを除去(枯渇)したTotal RNAライブラリーを迅速かつ簡便に構築できるキット。すべての生物種および試料から精製したRNAを用いて,バイアスがなく,正確なRNAライブラリーを構築できる。
法規制等
保存条件 4℃,-20℃,-80℃ 法規備考
掲載カタログ

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2週間程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 0
説明文
rRNAを除去(枯渇)したTotal RNAライブラリーを迅速かつ簡便に構築できるキット。すべての生物種および試料から精製したRNAを用いて,バイアスがなく,正確なRNAライブラリーを構築できる。
法規制等
保存条件 4℃,-20℃,-80℃ 法規備考
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Zymo-Seq RiboFree Universal cDNA Kit (12 preps)
2週間程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 0
説明文
Total RNAライブラリー作製用のrRNAを除去した一本鎖cDNA調製するキット。すべての生物種および試料から精製したRNAを用いて,バイアスがなく,正確なRNAライブラリーを構築できる。
法規制等
保存条件 4℃,-20℃,-80℃ 法規備考
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[在庫・価格 :2024年03月29日 00時00分現在]

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Zymo-Seq RiboFree Total RNA Library Kit (12 preps)

文献数: 10

説明文 rRNAを除去(枯渇)したTotal RNAライブラリーを迅速かつ簡便に構築できるキット。すべての生物種および試料から精製したRNAを用いて,バイアスがなく,正確なRNAライブラリーを構築できる。
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説明文 Total RNAライブラリー作製用のrRNAを除去した一本鎖cDNA調製するキット。すべての生物種および試料から精製したRNAを用いて,バイアスがなく,正確なRNAライブラリーを構築できる。
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[在庫・価格 :2024年03月29日 00時00分現在]

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詳細 商品名
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納期 文献数
PCR Strip MagStand
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お問い合わせ先

(テクニカルサポート 試薬担当)

reagent@funakoshi.co.jp

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表示価格に、消費税等は含まれていません。一部価格が予告なく変更される場合がありますので、あらかじめご了承下さい。