多検体mRNA試料から簡単・迅速にNGSライブラリーを調製できます MERCURIUS Multiplexed RNA-seq Library Preparation Kit

Alithea Genomics社は、自社のBRB-seq Technology^＊1を用いた3'mRNA-seq用のライブラリー調製キットを販売しています。同キットは、固有のバーコード配列（BRB-seq Barcode）およびpoly T配列を有するBRB-seq oligoを用いて、cDNA合成時に各試料にタグ付けを行います。各試料の3'末端に対しバーコード配列による固有のタグ付けを行うため、その後の反応は多数の試料を1本のチューブにプールしてNGS用のライブラリー調製を実施できます。従来法では試料数分の操作が必要でしたが、1本分の操作へと集約されることにより、ライブラリー調製の労力を大幅に削減することができます。
従来の3'mRNA-seq法は、遺伝子発現を解析するには良い手法ですが、全長を解析できないため、SNPsの検出やアイソフォームの同定などには不向きな手法です。そこで、Alithea Genomics社は全長mRNA-seqに対応したMERCURIUS Multiplexed RNA-seq Library Preparation Kitを開発しました。本キットは、最初に精製したRNA試料からmRNAを濃縮し断片化を行います。次に断片化したmRNAにpoly(A)を付加し、BRB-seq oligoを用いてcDNAを合成します。この反応で固有のバーコードを有した全長mRNA由来のcDNAを合成することが出来ます。そして、多数の試料を1本のチューブにプールしてライブラリー調製を実施します。本キットは、遺伝子発現解析のほか、SNPsの検出やアイソフォームの同定などの解析用途が広がります。

各精製RNA試料からmRNAを濃縮後、キットに付属の酵素によりmRNAを断片化します。断片化したRNAを修復し、ポリアデニル化の実施後に、BRB-seq oligoを用いて96ウェルプレートで逆転写反応を実施し、cDNAを合成します。この反応で、各試料に対して固有のバーコード配列をcDNA鎖に組込み、以降のステップは1本のチューブにプールして相補鎖の合成、アダプター付加、増幅操作とNGSライブラリーの調製反応を実施します。

＊2 mRNA濃縮用試薬やDNA精製ビーズなどはキットに付属していません。データシートを確認の上、別途必要な試薬や装置などをご確認下さい。

MERCURIUS Multiplexed RNA-seq Library Preparation Kitを用いて48試料から調製したライブラリーのシークエンシングを行った。検出された遺伝子数については、図中に示したそれぞれのCPM（counts per million）の閾値を超えている場合に検出されたと見なした。各試料において概ね均一に22,000以上の遺伝子が検出された。平均リード数：1,200万。

Human Universal Reference RNAの量（1 ug, 100 ng, 10 ng）を変えてライブラリーを調製した。RNA量が変化しても均一のマッピング率（80％）を示した。

Alithea Genomics社のBRB-seq KitおよびMERCURIUS Multiplexed RNA-seq Library Preparation Kitと他社の従来法キットを用いてmRNAの検出部位を比較した。3'mRNA-seq用のmRNA BRB-seq Kitはその手法通りに3'側の部位が多く検出されたのに対し、MERCURIUS Multiplexed RNA-seq Library Preparation Kitは、一般的な従来法のmRNA-seq Kitと同様に一定かつ均一に全長mRNAを検出した。

Alithea Genomics社のBRB-seq KitおよびMERCURIUS Multiplexed RNA-seq Library Preparation Kitと他社の従来法キットを用いてライブラリーをそれぞれの方法で調製し、検出されたアイソフォームの数を比較した。MERCURIUS Multiplexed RNA-seq Library Preparation Kitは、他社の従来キットと同等の検出数を示した。