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PCR由来のバイアスやキメラ形成を抑える16S rRNAライブラリー調製キット Quick-16S NGS Library Prep Kit

掲載日情報:2020/06/12 現在Webページ番号:68084

微生物叢(マイクロバイオーム)のプロファイリング時に用いられている,16S rRNA遺伝子の次世代シークエンシング(NGS)に最適なDNAライブラリーを調製するキットです。
ライブラリー調製時のPCR操作が1回のみでノーマライズのステップが不要となり,従来の製品と比べ,迅速(わずか30分)かつ簡便な操作でライブラリー調製が可能なQuick-16S Plus / Quick-ITS Plus NGS Library Prep Kitについてはこちらをご覧下さい。
本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。


PCRキメラの発生

図1:PCRキメラの発生について
本キットおよび微生物叢研究分野における標準的なプロトコル2種により,等量の糞便由来DNAからライブラリーを調製した際に生じたPCRキメラについて比較した。生じたPCRキメラは,Uchimeアルゴリズムで検出した。
本キットはリアルタイムPCRを用いることにより,PCRキメラが生じない適切なサイクル数を確認できる。
HMP Protocol(米国NIHのHuman Microbiome Projectのプロトコル)
EMP Protocol(米国Earth Microbiome Projectのプロトコル)


16S rRNA遺伝子のNGS解析について

微生物叢(マイクロバイオーム)のプロファイリングにおいて,16S rRNA遺伝子解析は,ショットガン法によるメタゲノム解析と比べて,コストパフォーマンスに優れる,確実性が高い,必要DNA試料量が少なくてすむ,宿主由来DNAの影響を受けない,といった優位点があります。しかしながら,16S rRNA遺伝子解析にも固有の課題があります。
大きな課題の1つはPCRキメラの形成です。これは2つ以上のPCRテンプレートの組換えによって生じる人為的な配列で,マルチテンプレートPCRにおいて,PCRの後期に生じやすくなっています。
さらなる課題として,共通の16Sプライマーを用いた場合,種レベルでの分離と,系統学的に広くカバーすることの両立を図ることが困難になります。その上,現在この研究分野で用いられている標準的な16S rRNAライブラリー調製法は,大規模アプリケーションにおいてコスト効率が高くなるようには最適化されていません。


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特長

  • ライブラリー調製に要する時間,手間,費用を,既存法と比べて大幅に削減しました。
  • PCR由来のバイアスやPCRキメラ形成を抑えることができ,ほとんどの場合PCRキメラの存在量は2%以下となります。
  • 独自の2組のプライマーセットを用いることで,バクテリア・古細菌を系統学的に広くカバーしたライブラリーを調製できます。
  • キットには必要な試薬がすべて含まれています。
  • 調製したライブラリーはイルミナ社のMiSeqシークエンシングにそのまま使用できます。

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本キットと既存法の操作法比較

本キット既存法
標的配列のPCRによる増幅標的配列のPCRによる増幅
未反応プライマーの酵素分解磁気ビーズキットによる核酸精製
PCRによるバーコード配列の付加PCRによるバーコード配列の付加
ライブラリーの定量およびプーリング磁気ビーズキットによる核酸精製
ライブラリーの定量
ライブラリーの最終精製
(各ライブラリーをプーリング後に精製)
各ライブラリーをノーマライズ後に
プーリング
  
トータルの操作時間:1.5時間トータルの操作時間:4時間

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他社製品との比較

本キット他社製品
操作時間1.5時間≧4時間
試料DNA事前のノーマライズ不要
DNA濃度の範囲:5~20 ng/μl
事前にノーマライズおよび定量が必要
調製したライブラリーの系統学的カバー範囲標準的なプライマーよりも極めて広い狭い
PCR後の精製キットに含まれる酵素での1ステップ処理で迅速かつ簡便市販の精製キットによる複数回の精製
バーコード配列の付加に必要なチューブ数20本(96試料あたり)96本(96試料あたり)
PCRキメラ発生の抑制<2%に抑制抑制していない
調製したライブラリーの定量定量的PCR
(キットに試薬が含まれている)
ゲル電気泳動またはBioanalyzerによる定量
(キットに試薬が含まれていない)

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ライブラリー調製時に生じるバイアスについて

調製時に生じるバイアス

図2:ライブラリー調製時に生じるバイアスについて
本キットおよび微生物叢研究分野における標準的なプロトコル2種により,ZymoBIOMICS Microbial Community DNA Standardを試料として16S rRNAライブラリーを調製した。その後シークエンシングを行い,ライブラリー調製時に生じるバイアスについて比較した。本キットで調製したライブラリーはバイアスが少なく,理論値(Theoretical)に近いことが分かる。
HMP Protocol(米国NIHのHuman Microbiome Projectのプロトコル)
EMP Protocol(米国Earth Microbiome Projectのプロトコル)

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調製したライブラリーの系統学的カバー範囲について

カバー範囲1

図3

カバー範囲2
図4
カバー範囲3
図5
カバー範囲4

図6

図3~6:調製したライブラリーの系統学的カバー範囲について
本キットで用いている独自の2組のプライマーセット(「Quick-16S primer set V1-V2」と「Quick-16S primer set V3-V4」)と,微生物叢研究分野における標準的なプライマーセットで調製したライブラリーの系統学的カバー範囲について比較した。
本キットで調製したライブラリーが,バクテリア・古細菌を系統学的に広くカバーしていることが分かる。
HMP(米国NIHのHuman Microbiome Projectのプライマーセット)
Loman Lab(英国バーミンガム大学Loman研究室のプライマーセット)
Klindworth(独国マックス・プランク研究所Klindworth氏の文献に記載のプライマーセット)
Klindworth, A., et al., Nucleic Acids Res., 41 (1), e1 (2013).


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キット内容

各キットコンポーネント名をクリックすると,単品の価格表をご覧いただけます。


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価格

[在庫・価格 :2021年09月25日 00時14分現在]

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納期 文献数
Quick-16S NGS Library Prep Kit (96reactions)
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説明文
微生物叢(マイクロバイオーム)のプロファイリング時に用いられている,16S rRNA遺伝子の次世代シークエンシング(NGS)に最適なDNAライブラリーを構築するキット。PCR由来のバイアスやPCRキメラ形成を抑えることができる。
法規制等
保存条件 室温,4℃,-20℃ 法規備考
掲載カタログ ニュース2020年2月15日号 p.13
ニュース2019年3月1日号 p.8

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[在庫・価格 :2021年09月25日 00時14分現在]

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Quick-16S NGS Library Prep Kit (96reactions)

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説明文 微生物叢(マイクロバイオーム)のプロファイリング時に用いられている,16S rRNA遺伝子の次世代シークエンシング(NGS)に最適なDNAライブラリーを構築するキット。PCR由来のバイアスやPCRキメラ形成を抑えることができる。
法規制等
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キット別売品

[在庫・価格 :2021年09月25日 00時14分現在]

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Quick-16S Primer Set V1-V2
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Quick-16S Primer Set V3-V4
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ZymoBIOMICS DNAse/RNAse Free Water
2週間程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 0
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微生物叢(マイクロバイオーム)研究用製品ZymoBOMICS DNA/RNA Kitのキットコンポーネント別売品。
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ZymoBIOMICS Microbial Community DNA Standard
2週間程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 0
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10種類の微生物(細菌および酵母)から抽出・精製したゲノムDNA混合物。微生物相,微生物叢(マイクロバイオータ,マイクロバイオーム)およびメタゲノミクス研究における標準試料(微生物スタンダード)として有用。
法規制等
保存条件 -20℃ 法規備考
掲載カタログ ニュース2020年2月15日号 p.4
ニュース2019年3月1日号 p.4

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掲載カタログ ニュース2020年2月15日号 p.4
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法規制等
保存条件 -20℃ 法規備考
掲載カタログ ニュース2020年2月15日号 p.4
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お問い合わせ先

(テクニカルサポート 試薬担当)

reagent@funakoshi.co.jp

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