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外来DNAの挿入位置解析受託サービス

掲載日情報:2020/06/12 現在Webページ番号:64832

合同会社PGL(ピージーエル)社が開発したPGL法を用いて,生物のゲノム中に含まれる外来遺伝子を検出/解析するサービスです。
本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。


PGL法とは

生物のゲノム中に含まれる外来遺伝子を検出する,PGL社が開発した手法です。探索したい遺伝子の配列がわかっていれば,ゲノム内のどこに入っているかが安価で解析できます。複数箇所にも対応できます。前後のゲノム配列との融合遺伝子として結果がわかります。

応用例:トランスジーンの導入位置の探索,ウイルスのインテグレーション位置の探索,融合遺伝子の探索など。


PGL法とは
  1. トランスジーンやウイルスDNAなどの外来DNAに特異的な外来DNA特異的プライマー(5’末端ビオチン化)と任意プライマーを用いて,外来DNAの近傍配列を増幅する。
  2. アフィニティー精製により,近傍配列を含むPCR産物を濃縮する。
  3. 濃縮されたPCR産物を鋳型にして再度PCRを行い,外来DNAの近傍配列を特異的に増幅する。
  4. アガロース電気泳動によりDNAフラグメントを分取後,キャピラリーシーケンサーにより近傍配列を解読し,外来DNAの挿入位置を決定する。


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外来DNAの挿入位置解析受託サービスの利用例

  • HTLV, HBV, HIVなどのウイルスによって宿主ゲノムに挿入されたウイルスゲノムの挿入位置の決定
  • CRISPR-Cas9を用いた遺伝子ノックインのオフターゲットによって生じた遺伝子挿入の位置決定
  • iPS細胞などの再生医療向け細胞株の安全性評価
  • 形質転換マウスのトランスジーン挿入位置の決定

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ご用意いただくもの

  • トランスジーンの配列情報
  • ご使用のベクターの種類
  • 精製したゲノムDNA2μg以上(100 ng/μl, A260/A280>1.6以上)

ご安心して受託試験をお出しいただくために,1ヵ所以上の挿入位置が決定された場合のみ料金をご請求させていただきます。その条件は,ユーザー様ご自身がPCR等により,本件で扱うトランスジェニック生物のゲノム上にトランスジーン挿入をご確認いただいていること,となります。


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外来DNAの挿入位置解析受託サービスの解析例

形質転換マウスのトランスジーン挿入位置の決定

形質転換マウスのトランスジーン挿入位置の決定 [手順]
  1. マイクロインジェクションによって作製された形質転換マウスからゲノムDNAを抽出する。
  2. PGL法を用いてトランスジーン近傍配列の特異的増幅を行う。(左図)
  3. アガロース電気泳動によって分離されたDNAフラグメントを回収する。
  4. キャピラリーシーケンサーを用いてトランスジーン近傍配列を解読する。
  5. マウスゲノムとトランスジーンの融合配列を確認する。
  6. 近傍配列のBlast検索でマウスゲノム上のトランスジーンの挿入位置を決定する。

[結果]
異なるトランスジーンを持つ形質転換マウス4系統において,それぞれの系統で複数のトランスジーン挿入およびその挿入位置を決定することができた。

[決定されたトランスジーン挿入位置]
(系統1) a:Chr8:124,…,….  b:Chr6:52,…,….
(系統2) c:Chr3:10,…,…. d:Chr1:154,…,…. e:Chr8:115,…,….
(系統3) f:Chr16:54,…,…. g:Chr14:82,…,….
(系統4) h:Chr12:120,…,…. i:Chr10:79,…,…. j:Chr1:98,…,…. 
k:Chr12:37,…,….
未発表データのため,挿入位置の下6桁は「 …,….」で表示しています


ヒト培養細胞に挿入されたウイルスDNAの挿入位置決定

ヒト培養細胞に挿入されたウイルスDNAの挿入位置決定 [手順]
  1. マイクロインジェクションによって作製された形質転換ヒト培養細胞からゲノムDNAを抽出する。
  2. PGL法を用いたトランスジーン近傍配列の特異的増幅を行う(左図)。
  3. 電気泳動によって分離されたDNAフラグメントの回収する。
  4. キャピラリーシーケンサーを用いてトランスジーン近傍配列を解読する。
  5. 近傍配列のBlast検索により,ヒトゲノムとウイルスゲノムの「融合配列」を確認する。

[結果]
異なるトランスジーンを持つヒト培養細胞2系統において,それぞれの系統で複数のトランスジーン挿入およびその挿入位置を決定することができた。

[決定されたトランスジーン挿入位置]
(系統1) a:Chr14:15,…,….  b:Chr3:127,…,….
(系統2) c:Chr5:27,…,…. d:Chr15:97,…,…. e:Chr5:98,…,….
未発表データのため,挿入位置の下6桁は「 …,….」で表示しています。


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