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cfDNAなど劣化した試料に最適なNGS Library作製キット 一本鎖DNAライブラリー調製キット（SRSLY Prep Kit）

掲載日情報：2024/01/30 現在Webページ番号：71265

クラレット バイオサイエンス /
Claret Bioscience
[メーカー略称：CAT]

Single Reaction Single-stranded DNA LibrarY Prep Kit（SRSLY Prep Kit）は、シンプルで効率的なライゲーションベースのIllumina社NGS用の一本鎖DNAからのライブラリー調製キットです。法医学試料由来のDNA、古代DNA（Ancient DNA）、セルフリーDNA（cfDNA）などの劣化した核酸試料、in vitroで切断したDNA、合成オリゴヌクレオチドやプローブ、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）試料など由来の損傷DNA、そしてFirst Strand cDNAまで、試料の種類に関係なく使用できます。

※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

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SRSLY Prep Kitについて

試料のDNAにはさまざまな形態があります。例えば、一本鎖DNA（single strand DNA, ssDNA）や断片化されてオーバーハングを持つ二本鎖DNA（Fragmented dsDNA with overhang）、断片化されて平滑末端を持つ二本鎖DNA（Fragmented dsDNA with blunt ends）、損傷を持つDNA（Dameged / Nicked DNA）などがあります。

SRSLYキットの説明（DNA試料の多様性）

Claret Bioscience社のSRSLY Prep Kitでは、すべてのDNAを一本鎖DNA（████）にした後、一本鎖DNAにアダプターを付加してライブラリーを調製します。


ニックがある二本鎖DNAも、このような手法によりニックで切れた箇所にアダプターを付加することが可能となり、取りこぼしが無くなります。また、従来の二本鎖DNAベースのアダプターライゲーション方式では、平滑末端化やdA tailingを実施しますが、SRSLY法では一本鎖に直接アダプターをライゲーションする手法であるため、ネイティブな末端配列を保持することができ、また失われる可能性のある一本鎖DNA、損傷を受けた二本鎖DNAなども回収することができます。
さらに、一本鎖DNA状態が安定に保たれるようにssEnhancer（●）を使用しています。ssEnhancerは一本鎖DNAに結合し、二本鎖へと戻ることが無いように安定化して、その後の反応を効率的に進めることができます。

SRSLYキットの説明（キットの強み）


通常ライゲーションに使用されるT4リガーゼは、一本鎖DNAを結合させる場合には二本鎖DNAを使用した場合と異なりライゲーション効率が低下します。そこで、SRSLY Prep Kitではランダムな配列を有するSplint sequenceをアダプターに導入し、この問題を解決しました。Splint sequenceは一本鎖DNAに結合するアダプター配列の相補鎖側の3’末端に突出末端として導入されています。このSplint sequenceと対象のDNAが結合することで、二本鎖DNAを付加させるような状況を作り出し、T4リガーゼによる付加反応が高効率となる工夫がされています。

SRSLYキットの説明（リン酸化）

矢印

Index PCRに進みます。



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SRSLY Prep Kit（UMI付加）のワークフロー(動画)

SRSLY Prep Kitのワークフロー（UMI：Unique Molecular Index配列を付加する場合）については、以下の動画からもご確認頂けます。



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特長

  • FFPE試料由来のDNA、古代DNA、考古遺伝学（Archaeogenetics）試料、cfDNAなど損傷を受けたDNAや一本鎖DNAからライブラリーを調製できます。
  • ネイティブな末端配列を維持した解析が可能です。
  • DNA試料から2.5時間でNGS用（Illumina社）のライブラリーを調製できます。
  • バイサルファイト処理DNAや古代DNA、一部のFFPE試料由来のDNAなどウラシルを含む試料に対応したPCR polymeraseを含むUracil+ Kit製品もあります。
  • DNA試料の量に応じて、NanoPlus（試料量：10～50 ng）、およびPicoPlus Kit（試料量：250 pg～10 ng）を選択できます。
  • 酵素法に対応をしたDNAせん断化酵素ForShearも別売品であります。

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SRSLY Prep Kitの各キットの概要とパーツの選択法

SRSLY Prep Kitの概要とパーツの選択法

実験条件や用いる試料に応じて、各キットを以下に従ってご選択下さい。

1. Base Kit Type
・ライブラリー調製キット：試料DNAの量に応じて、NanoPlus（試料量：10～50 ng）およびPicoPlus Kit（試料量250 pg～10 ng）から選択して下さい。古代DNA, バイサルファイト処理DNA, 一部のFFPE試料などウラシルを含むDNA試料を用いる場合には、Uracil+シリーズを選択します。ただし、UMI/UDI Primer Setを選択する場合、通常キットの選択で構いません。

2. Number of Reactions
・Base Kitの反応数を24または96 reactionsから選択して下さい。

3. UMI addition and Primer Strategy
・Index PrimerはUDI（Unique Dual Index）あるいはUDIを含むUMI（Unique Molecular Index）から選択して下さい。

4. Clarify Beads
・核酸精製用ビーズ：24または96 reactions分の容量から選択して下さい。
※ 別途マグネットセパレーターをご用意頂く必要があります。

5. Shearing（ForShare 24/96）
・DNAせん断化用酵素：ゲノムDNA（FFPEや凍結切片から抽出したDNAなど）のせん断化の際に、酵素法を用いることが出来ます（ソニケーションによるせん断化を実施する場合は不要です）。
・推奨インプットDNA量：10～50 ng（NanoPlus Kitの使用を推奨）。24または96 reactions分の容量から選択して下さい。

SRSLY DNA Library Prep Kitシリーズ一覧表

※ 商品コードをクリックすると価格表をご覧いただけます。
製品グループ キット内容 品名 商品コード
SRASLY DNA NGS Library Preparation Base Kit ssEnhancer、
SRSLY NGS adapter A、B、
SRSLY master mix、
Index PCR master mix		 PicoPlus（24 reactions） CBS-K250B-24
PicoPlus（96 reactions） CBS-K250B-96
NanoPlus（24 reactions） CBS-K155B-24
NanoPlus（96 reactions） CBS-K155B-96
PicoPlus Uracil+（24 reactions） CBS-K250B-U-24
PicoPlus Uracil+（96 reactions） CBS-K250B-U-96
NanoPlus Uracil+（24 reactions） CBS-K155B-U-24
NanoPlus Uracil+（96 reactions） CBS-K155B-U-96
Unique Dual Indexing PCR Primers i7 and i5 UDI primer pairs 24 UDI Primer Set for 24 reactions CBS-UD-24
96 UDI Primer Set for 96 reactions CBS-UD-96
Unique Molecular Index with Unique Dual Indexing PCR Primers UMI reaction buffer、
UMI reaction enzyme、
i7 UMI index primers、
i5 UDI and Ui7 primer pairs 		12 UMI/UDI Primer Set for 24 reactions CBS-UM-24
96 UMI/UDI Primer Set for 96 Reactions CBS-UM-96
DNA Purification Beads Clarefy DNA purification beads Clarefy Beads（8 ml） CBS-BD-24
Clarefy Beads（30 ml） CBS-BD-96
Enzymatic Fragmentation Module ForShear activity buffer、
ForShear dilution buffer、
ForShear shearing enzyme		 ForShear（24 reactions） CBS-ESM-24
ForShear（96 reactions） CBS-ESM-96


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使用例

他社製品との比較

SRSLY DNA Library Prep Kitと他社キットとの比較表

使用キット
・ClaretBio SRSLY Prep Kit
・dsPrep-A, -B（dsDNA用のライブラリー調製キット2種類）
・ssPrep（ssDNA用のライブラリー調製キット）
試料：cfDNA（1ng）
 それぞれのキットを使用してセルフリーDNA（cfDNA）試料からライブラリーを調製し、NGSで解析した。SRSLY Prep Kitを用いた場合、得られるライブラリー収量が安定して高く、30～100 bpの短い断片も効率良く得られている。

＊マッピング性能（Mapping Rate）に関する比較

マッピング性能に関する比較

左図. 本製品のマッピング率は、他社製品と同等以上の結果が得られた。
右図. 30～100 bpの短い断片に注目すると、本製品は、他社の製品よりも短い断片を効率良く捕捉し、解析できていることが分かる。


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Topics：cfDNAに含まれる短鎖DNAの貴重な情報

血漿由来のセルフリーDNA（cfDNA）から抽出されたDNA断片の多くは167 bp付近に集中しており、加えて10.4 bpの鋸歯状パターンが観察されます。これは、DNaseⅠが露出したヌクレオソーム結合DNAの副溝を切断した結果です。さらにこの画分には、転写因子やその他のDNA結合タンパク質、ミトコンドリアDNA、微生物由来のDNAの”フットプリント“を含む短いサイズのDNA断片（30～100 bp）が少数含まれており、これらはすべて、cfDNAから得られる貴重な配列情報となります。一方目的に応じて、サブヌクレオソームサイズのデータやDNAの末端情報を割愛したり、鋸歯状パターンをなくす目的に対応したDNA抽出法を採用している場合もあります。

SRSLYキットは短鎖DNA由来の貴重な情報を逃さない
参考文献：
  • Snyder, M.W., et al., "Cell-free DNA comprises an in vivo nucleosome footprint that informs its tissues-of-origin," Cell, 164(1-2), 57～68 (2016). [PMID: 26771485]
  • Chen, J., et al., "Plasma contains ultrashort single-stranded DNA in addition to nucleosomal cell-free DNA," iScience, 25(7), 104554 (2022). [PMID: 35800774]

・他社の二本鎖DNA用キットとの比較

他社の二本鎖DNA用キットとの比較

cfDNA試料から、本製品（SRSLY）と他社の二本鎖DNA用NGSライブラリー調製キット（dsPrep-A、dsPREP-B）で調製したライブラリーを解析し、得られた配列長の全体に占める割合を比較した。本製品は他社製品よりも短い断片の回収で優れていることが分かる。


・解析断片長の比較

解析断片長の比較

cfDNA試料から、本製品（SRSLY）と他社の一本鎖DNA用NGSライブラリー調製キット（ssPREP）で調製したライブラリーを解析し、得られた配列長の全体に占める割合を比較した。他社製品は、すべてのデータを人工的に10 bp短くシフトさせる分子法を採用しているため、本製品よりも解析した配列長が10 bp程度短くなる。


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主な使用文献および参照文献

█ ゲノムDNA

  • Miller, K.E., et al., "Post-zygotic rescue of meiotic errors causes brain mosaicism and focal epilepsy.", Nat. Genet., 55(11), 1920～1928 (2023). [PMID: 37872450]

█ cfDNA

  • Kim, J., et al., "Multidimensional fragmentomic profiling of cell-free DNA released from patient-derived organoids.", Hum. Genomics, 17(1), 96 (2023). [PMID: 37898819]
  • Chang, A., et al., "Measurement Biases Distort Cell-Free DNA Fragmentation Profiles and Define the Sensitivity of Metagenomic Cell-Free DNA Sequencing Assays.", Clin. Chem., 68(1), 163～171 (2021). [PMID: 34718476]
  • Oreskovic, A., et al., "Characterizing the molecular composition and diagnostic potential of Mycobacterium tuberculosis urinary cell-free DNA using next-generation sequencing.", Int. J. Infect. Dis., 112, 330～337 (2021). [PMID: 34562627]
  • Cheng, L.Y., et al., "Direct capture and sequencing reveal ultra-short single-stranded DNA in biofluids.", iScience, 25(10), 105046 (2022). [PMID: 36147958]

█ 古代DNA

  • Horsburgh, K.A., et al., "Maternal Relationships among Ancient and Modern Southern African Sheep: Newly Discovered Mitochondrial Haplogroups.", Biology (Basel), 11(3), 428 (2022). [PMID: 35336803]
  • Horsburgh, K.A., et al., "Origins of Polynesian Pigs Revealed by Mitochondrial Whole Genome Ancient DNA.", Animals (Basel), 12(18), 2469 (2022) [PMID: 36139328]
  • Zavala, E.I., et al., "Ancient DNA Methods Improve Forensic DNA Profiling of Korean War and World War II Unknowns.", Genes (Basel), 13(1), 129 (2022). [PMID: 35052469]

█ メタゲノム

  • Dickson, Z.W., et al., "Probe design for simultaneous, targeted capture of diverse metagenomic targets.", Cell Rep. Methods, 1(6), 100069 (2021). [PMID: 35474894]
  • Mzava, O., et al., "A metagenomic DNA sequencing assay that is robust against environmental DNA contamination.", Nat. Commun., 13, 4197 (2022). [PMID: 35864089]


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SRASLY DNA NGS Library Preparation Base Kit

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SRSLY PicoPlus Kit(24reactions)
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cfDNAやancient DNA（aDNA）などの解析に有用なDNA用ライブラリー調製キット。
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掲載カタログ ニュース2023年10月1日号 p.30

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SRSLY PicoPlus Kit(96reactions)
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SRASLY PCR Primers

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96 Combinatorial UMI Primer Pairs for 96 reactions
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96 Combinatorial UMI Primer Pairs for 96 reactions

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SRASLY Beads, Enzyme


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Clarefy Beads
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Clarefy Beads
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Clarefy Beads

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ForShear(24reactions)

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（テクニカルサポート 試薬担当）

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PCR・シークエンシング