DNAメチル化解析受託サービス（Zymo Research社） 次世代シークエンシングを用いたエピジェネティクス解析受託サービス

DNAのメチル化は、DNA分子の化学修飾です。ほとんどの場合、DNAのメチル化は、シトシンの5炭素位にメチル基が共有結合して 5-メチルシトシン（5mC）を形成することを指します（図1、左側の2つの構造）。DNAメチルトランスフェラーゼはこの反応を担っており、ゲノム全体でDNAのメチル化パターンを確立および維持します。DNAのメチル化は、ヌクレオチドの配列を変更せずに遺伝子発現を制御します。したがって、DNAのメチル化はエピジェネティックマークの一つであり、「epi」は、この機能がDNA配列を変更することなくその役割を果たす遺伝学の「上」にあることを意味しています。

DNAのメチル化は、最も広範に研究されているエピジェネティックマークの1つです¹。真核生物では、DNAのメチル化はCpGジヌクレオチドで広く発生します。プロモーター、遺伝子本体、エンハンサーでのDNAメチル化のパターンは、遺伝子発現の調節に重要な役割を果たします^2～4。

DNAメチル化のパターンのいくつかは広く研究されており、遺伝子発現の調節に関する知見が得られています。

プロモーター領域におけるDNAの過剰メチル化（DNAのメチル化レベルの大幅な増加）は、一般に遺伝子抑制またはサイレンシングと関連しています。例として、DNAの過剰なメチル化はX染色体を不活性化し、反復DNA部位をサイレンシングする働きをします²。ハウスキーピング遺伝子および発達調節遺伝子のプロモーターと関連するCpGアイランド（CGI、GpG サイトが高頻度に存在する領域）のCpG部位は、通常、DNAのメチル化に対して抵抗性があります。ただし、これらのプロモーターのCGIは、腫瘍抑制遺伝子およびDNAミスマッチ修復遺伝子で異常にメチル化されていることが判明しており、これが関連遺伝子の活性化および発現を抑制します。プロモーターCGIにおけるこのような異常なDNAのメチル化パターンは、がんにおいて最も広く研究されているエピジェネティックな変化です^3,4。 エンハンサーのCpGには、組織または細胞タイプに特有なDNAのメチル化パターンが含まれていることがわかっています。このような差次的メチル化領域（DMR、Differentially Methylated Region）は、異なる組織および細胞タイプ間において独自の遺伝子発現に寄与している可能性があります⁵。正確な遺伝子調節は、多くの基本的な生物学的プロセスにとって重要であり、DNAのメチル化は生物の発達と恒常性維持に不可欠です。多様な条件下でさまざまな生物種由来の試料のDNAメチル化パターンを解明し、遺伝子調節機構における役割を調べることで、DNAのメチル化が、人間の病気や老化、および生態系の健全性にどのように影響するかについての理解を深めることができます。

最も標準的なDNAのメチル化分析方法は、亜硫酸水素塩処理によるものです。亜硫酸水素塩試薬は、メチル化されていないシトシン残基をウラシルに変換し（図1、3番目の構造）、メチル化されたシトシンは反応しません。PCR中、DNAポリメラーゼはウラシルをチミンとして認識し、その後の分析ではDNA試料内の「C」をメチル化シトシンとして、「T」（図1、最後の構造）をメチル化されていないシトシンとして扱います。

NGSベースの方法は、ゲノム全体にわたって高い網羅率の結果を生み出し、あらゆる種と互換性があります。そのため、亜硫酸水素塩シークエンシングはDNAメチル化のプロファイリングで一般的に広く用いられています。亜硫酸水素塩処理したDNA試料は、互換性のあるNGS機器でシークエンシングするために、アダプターを含んだライブラリｰを構築する必要があります。メチル化されたシトシンは、NGSでは「C」として認識されます。

最も広く使用されているNGS法には、Reduced representation bisulfite sequencing法（RRBS）、Whole-genome bisulfite sequencing法（WGBS）、および標的バイサルファイトシークエンス法があります。これらの方法は、亜硫酸水素塩処理、アダプターライゲーション、PCR増幅などのライブラリー調製の手順は共通していますが、入力DNA試料を準備するワークフローの開始時において若干の違いがあります。

RRBSは、制限酵素消化を使用して、DNA試料からゲノム全体のCpGに富む領域を濃縮し、次にバイサルファイトシークエンシングライブラリーを調製します。RRBSは、WGBSのように亜硫酸水素塩処理したゲノム全体をシークエンシングする場合と比較して、同様のデータ品質を達成するために必要なシークエンシングリード数を減らし、プロモーター、CpG アイランド、遺伝子本体などの最も重要な調節領域のDNAメチル化情報を明らかにします。RRBSは、WGBSで通常必要なシークエンシングリードの約10～20%で、プロモーター、CpG アイランド、遺伝子本体の70%以上とエンハンサーの約35%をカバーできます。

シークエンシングにおいて、RRBSはWGBSよりもコスト効率が高く、大規模な研究でゲノム全体のDNAのメチル化情報をスクリーニングするのに最適です。