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高精度な3’末端mRNA-Seq測定/ライブラリー構築キット MACE(Massive Analysis of cDNA Ends) Kit

掲載日情報:2020/01/23 現在Webページ番号:65499

3'末端解析手法 MACE(Massive Analysis of cDNA Ends)のライブラリー構築キットです。mRNAの3’末端の選択的ポリアデニル化の解析をはじめ、遺伝子型決定、対立遺伝子発現頻度解析に有用です。3'末端のみを解析できるため、低いシーケンス深度で正確なmRNAコピー数の定量解析が可能です。

MACE Kit専用の解析サービスもあります。詳細はお問い合わせ下さい。

MACEキット製品外観

製品外観

MACE Kitと一般的なRNA-Seq調製キットとの比較

most effectively

ダミーRNA試料にERCCコントロールRNAを微量spik-inし、MACEキットおよび他社の一般的なRNA-Seq調製キットでライブラリーを調製した後、各手法で検出できたERCCコントロールRNAの数を定量した。MACE Kitは6 Mリード、RNA-Seqは50 Mリードでシークエンスを行ったところ、MACE Kitは約1/10のシークエンス深度であるにもかかわらず、より多くのspik-in ERCCコントロールRNAを検出できていることが分かる。このデータは一般的なRNA-seqに比べ微量RNA種の検出に優れていることを示す。

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動画 GenXPro社(GXP社)のMACEおよびTrueQuantを用いた遺伝子型決定

MACEを用いた20Mシークエンシングリード実施例の動画です。MACEによって対立遺伝子が明確に示されました。

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MACE, TrueQuantおよびTranSNIptomicsとは

MACE, TrueQuantおよびTranSNIptomicsとは (クリックで開閉します)

MACE (Massive Analysis of cDNA Ends)

転写因子またはレセプターなど、研究対象として注目度の高い因子は、通常低コピー数で存在しています。一方、トランスクリプトームの約80%は、構造タンパク質などの多くの転写産物で占有されています。マイクロアレイでは、低発現(1~20コピー)の転写産物を通常は検出できないために、1億個以上の転写産物の解析が必要となります(下図参照)。一方、RNA-Seqでは、転写産物のサイズが大きいものほどリード数が大きくなり(過大評価され)、短いものは少なくなる(過小評価される)ためデータの正規化を要しますが、その方法によって結果が異なってしまう問題があります。

MACEは、3’末端由来のcDNAを特異的に解析します。マルチプレックス後においても必要な分解能を有し、次世代シークエンシングにより数千万個の転写分子の同時分析が行えます。RNA Seqでは、各転写産物は10~30個の断片で表されるため、MACEと同等の分解能を得るには10~30倍以上の配列決定を行う必要があります。

トランスクリプトーム解析

MACE(左図)とマイクロアレイ(右図)のトランスクリプトーム解析

転写産物種の57%は3~9コピー/100万個しか存在しない。転写物種の約70%を占める中および低レベルの転写物はマイクロアレイ上では検出不能であるが、MACEは低コピーの転写物までカバーし検出できる。

TrueQuant

次世代シークエンサーに基づく配列データは、異なるDNA断片が異なる効率で増幅されるためにPCRのバイアスを受け易いという問題点がありました。GenXPro社が独自に開発した"TrueQuant"技術を用いることにより、PCRのバイアスのないシークエンシングデータが得られます。

TrueQuant

異なる遺伝子発現におけるp値の負の常用対数の比較

TrueQuantを使用したPCRバイアスを回避したデータ(青色)とPCRバイアスを含むデータ(赤色)では、p値が明らかに異なることが示された。


TranSNiPtomics

転写産物の3’末端の多くは、進化的圧力の低いSNPやIndelsなど多くのシークエンシング多型を含む非翻訳領域(3’-UTR:3’ untranslated regions)を含んでいます。3’UTRは、ゲノム内ではなく遺伝子内に位置し、しばしば特定の形質に直接関連する貴重なゲノムマーカーとなります。MACEでは、各転写産物の3’末端に特化することにより、低コピー数の転写産物においてもSNPの同定に十分なカバレッジを得ることができます。一方、RNA-seqを用いた場合、同等の配列決定深度ではSNPを検出できません。(下図参照)。さらにMACEは、プロセスの並列化にて数百のサンプルを同時解析ができるために遺伝子型判定に最適です。

20Mシークエンシングリード実施例
TranSNiPtomics

RNA-seqでは同定できないSNPも(左図)、MACEではSNPの多い3’-UTRを集中的にシークエンシングすることにより同定できる(右図)。

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特長

  • 低発現率の転写因子やレセプターなどの転写産物を正確に解析できます。
  • 独自の定量技術TrueQuantにより、PCR由来のバイアスの影響を回避できます。
  • 高いシークエンスカバレッジにより信頼性の高いSNP検出および遺伝子型解析が行えます。
  • 数百試料のハイスループットな同時解析が可能です。
  • 頻出タグはコンティグとしてアライメントでき、全タグにアノテーションが付けられてデータベースに入力およびカウントされ、SNP(一塩基多型:Single Nucleotide Polymorphism)が同定できます。
  • MACEは、転写産物1分子あたり1リードのみが読み取られるため、全長RNA-Seqと比べて短くコピー数の少ない転写産物を10~20倍低いシーケンス深度で同定でき、また転写産物の長さによるデータの正規化も不要となるなどの様々な優位性を有します。
  • イルミナのNextSeq, NovaSeq, MiSeq, NovaSeq, MiniSeq、および iSeqに使用できます。

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比較例

MACE は転写産物の狭い範囲(多型が豊富な部分)の読み取りを集中して行うため、リード深度が増え、対立遺伝子をより正確に発見できる。

MACE vs RNA-Seq

同じシークエンス量(20 M リード)解析で同定できた異なる転写物数

MACE vs RNA-Seq

>30×のシークエンス(読み)深度で配列が得られた遺伝子座数
試料:ヒト胎盤組織


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使用例

ヒトhuvec細胞からのMACE解析例をダウンロードしてご参照下さい。


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使用文献

  • Boneva, S., et al, Laboratory Investigation, 100, 1345 (2020). [PMID:32467590]

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適用

  • 対立遺伝子の特異的発現(ASE:Allele Specific Expression)解析
  • 高精度医療研究
  • 植物育種研究
  • 選択的ポリアデニル化(APA:Alternative Poly-Adenylation)解析

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操作方法概略

  1. total DNAの断片化
  2. 逆転写
  3. DNAのプール(オプション)
  4. PCRによる増幅
  5. 磁性ビーズによる精製
  6. 次世代シークエンス
rapidMACEの操作法概略図

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キット内容

  • Nuclease-free water
  • TE buffer
  • RT buffer
  • RT enhancer
  • RT enzyme
  • PrePCR enzyme
  • RT primers
  • PCR buffer
  • PCR enzyme
  • PCR primers

DNA断片を精製するためのSPRI Beads(磁性ビーズ)および磁性スタンドはキットに含まれていません。別途ご用意下さい。
参考磁性ビーズ製品:Zymo Research社 Select-a-Size MagBead Set (#D4084)
参考磁性スタンド:Zymo Research社 ZR-96 MagStand (#P1005)

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メーカーインタビュー: 3’mRNA解析から新しい研究の提案へ

GenXPro GmbH

GenXPro 社は2005 年にDr. Peter Winter を筆頭に、フランクフルト大学・パリ大学の共同研究者が立ち上げた大学発ベンチャー企業です。同社は世界初の3’mRNA-Seq 技術(特許申請中)を有しており、2013 年から3’mRNA-Seq 用キット(MACE Kit)の販売を開始しました。今回は、同社のDr. Bjorn Rotter にお話を伺いました。

Dr. Bjorn Rotter

Frontiers

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価格

[在庫・価格 :2024年07月15日 14時15分現在]

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Select-a-Size DNA Clean & Concentrator MagBead Kit (10ml)
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ライブラリー調製やPCR,制限酵素処理,ライゲーション反応後などの試料から特定範囲のDNA断片を磁気ビーズを用いて精製可能なキット。※マグネットスタンドが必要。
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Select-a-Size DNA Clean & Concentrator MagBead Kit (10ml)

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