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guide RNAによるゲノム編集ツール CRISPR-Cas9 システム <特集>

掲載日情報:2015/06/11 現在Webページ番号:8508

CRISPR-Cas9システムとは

MEMO

CRISPR-Cas9システムとは


CRISPR-Cas9 システムは,ゲノム中で任意の領域を切断できる遺伝子改変ツールです。切断したい標的塩基配列に相補的な配列を含むguide RNA(crRNA:tracrRNA) とDNA 切断酵素Cas9 タンパク質により,ゲノム上の任意の配列を切断します。標的配列のデザインの簡便さや実験手法の容易さから,本システムはZinc Finger NucleaseやTALE Nuclease と並び,注目されるゲノム編集技術です。

CRISPR-Cas9システムとは

切断したい標的塩基配列を含むguide RNA(crRNA:tracrRNA)とCas9 タンパク質により,ゲノム上の任意の配列を切断します。
crRNA: CRISPR RNA, tracrRNA: trans-activating CRISPR RNA

遺伝子のノックアウト

CRISPR-Cas9 システムでのゲノムの切断後NHEJ による修復が起こり,塩基の置換や欠損が誘引され,これにより遺伝子のノックアウトができます。また,切断した部位に特定の配列をノックインしたい場合には,その目的配列を含むドナーベクターを一緒にトランスフェクションすると,相同組換え(HDR)によりその配列をノックインすることができます。

■配列のデザイン方法

標的配列は,末端に「GG」が配置されている領域を選択し,NGG の上流20 塩基で設計します。切断したい標的配列を含むgRNA およびその相補鎖をオリゴ合成等で作成していただきます。

標的領域                           5’ NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG 3’
デザインする配列の例 5’TGTATGAGACCACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3’
        3’ACTCTGGTGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA 5’

ラインナップにより,標的配列の両端に付加する配列は変わります。

ウェブ上で公開されているguide RNA 設計用のソフトウェア

■操作方法概略

切断したいDNA 配列に対する相補的な配列を含むguide RNA,およびその相補鎖を設計し,それらの断片をCRISPR ベクターにクローニングします。作製したCRISPR-Cas9 発現プラスミドを目的細胞へトランスフェクションすると,CRISPR-Cas9 システムにより標的領域が切断されます。

また,Cas9 のmRNA,guide RNA をそのまま細胞にトランスフェクションする方法では,ホスト内での免疫反応が生じにくく,速やかに標的配列の切断を起こすことができます。

MEMO

Cas9 Nickase(Cas9(D10))について


Cas9 の変異体D10A は,Nickase として機能することが報告されています* 1。Cas9(D10A)は,野生型Cas9 のようにDNA 二本鎖を切断せず,一本鎖のみを切断しニックを入れます。そのため相同組換えによるゲノム編集において,二本鎖切断により引き起こされるDNA 修復機構NHEJ(非相同末端再結合)が起こらず,望ましくない領域での遺伝子欠失・挿入やオフターゲット効果を抑制することができます* 2。また,最近では2種類のguide RNA を用いて2か所にニックを入れることで,二本鎖切断によるノックアウトで細胞株におけるオフターゲット効果を50 ~ 1,500 倍まで減少できた例が報告されています* 3

*1 Jinek, M., et al., Science, 17, 337(6096), 816 ~ 821 (2012).
*2 Cong, L., et al., Science, 15, 339(6121), 819 ~ 823 (2013).
*3 Ran, F. A., et al., Cell, 12, 154(6), 1380 ~ 1389 (2013).

>Cas9 Nickase(Cas9(D10))について

標的部位のセンス鎖に対するguide RNA 1 とアンチセンス鎖に対するguide RNA 2 を作製し,Cas9 (D10A) を用いて2か所でニックを入れ,オフターゲット効果を抑制する。



MEMO

Cas9 Double Mutant について


Cas9 のDouble Mutant (D10A, H840A) はヌクレアーゼ活性およびNickase 活性を有していませんが,guide RNA 標的配列への結合能を有しています。オフターゲット効果の少ない転写リプレッサーとして機能すると考えられており* 4,部位特異的な転写制御の研究への応用が期待されています。

*4 Qi LS., et al., Cell, 152 (5): 1173-83 (2013).

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CRISPR-Cas9システム製品ラインナップ

All-in-one Vector System RNA System Lentiviral System
guide RNA とCas9 タンパク質を1 つのベクターから発現できます。細胞株でのゲノム編集に有用 ES 細胞やin vivo実験での使用に最適 Cas9 安定発現細胞株の構築などに有用
All-in-one Vector System RNA System Lentiviral System

■製品ラインナップ

■製品ラインナップ

■製品ラインナップ

Multiplex gRNA Cloning Kit HR Targeting Vector 各種受託サービス
直線化したgRNA ベクターまたはCas9 All-in-one ベクターに,複数のguide RNA をクローニングできるキット 相同組換えを利用したゲノム編集用ドナーベクター ゲノム編集関連の各種受託サービス

■製品ラインナップ

  • ノックアウト・修復用ドナーベクター
  • ノックイン用ドナーベクター
  • GFP・RFPタグ導入用ベクター

■受託サービスラインナップ

  • CRISPR-Cas9/guide RNA発現ベクター作製サービス
  • HRドナーベクター作製サービス
  • ゲノム編集済み細胞株作製サービス

■System Biosciences 社のCRISPR-Cas9 システムの比較

Cas9 の種類 機能 標的への効果 標的効率 HDR 効率 オフターゲット効果
Cas9 SmartNuclease NHEJ やHDR による高効率なゲノム編集 DNA 二本鎖の切断
Single Cas9 SmartNickase HDR によるゲノム修飾 ニックの導入(1か所) 検出限界以下
Pairing of Cas9 SmartNickase NHEJ やHDR による非常に正確かつ高効率なゲノム編集 ニックの導入(2か所)
Cas9 NullNuclease (Double Mutant) 遺伝子発現調節 標的配列に結合するがDNA を切断しない

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Cas9の検出

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reagent@funakoshi.co.jp

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