NHEJを利用し、幅広い細胞で高効率に遺伝子ノックアウトを行えます KN2.0 Non-homology Mediated CRISPR Gene Knockout Kit

※ 5Fおよび3Rプライマーは標的遺伝子に特異的な物が必要で、その配列は標的遺伝子のゲノム配列からデザインする必要があります。

HEK293細胞にgRNA1とドナーDNAをトランスフェクトし、ピューロマイシン選択を行って得られた安定細胞プールから単一細胞コロニー（1～6）を単離した。単離した細胞からゲノムDNAを抽出し、5F／3Rプライマーの組合せでゲノムPCRを行った。WTは未改変のHEK293細胞から抽出したゲノムDNA。

ゲノム編集なしおよびindelが生じた場合は0.75 kbのPCR産物が、ドナーDNA組込みが生じた場合は3.4 kbのPCR産物が得られる。
6つの細胞コロニー中の、1、4、５の3つのクローン（50％）で、ドナーDNAの組込みが生じていることが示された。

0.75 kbのPCR産物をシークエンシングして、ノックアウト部位でのindelを確認した（両アレルについて、一方にドナーDNAの組込み、もう一方にindelが生じていることが確認された）。

確認例１：ノックアウト部位にT（チミン）の挿入が確認された

確認例２：ノックアウト部位に2塩基の挿入と1塩基の置換が確認された

KN2.0 CRISPR Gene Knockout Kitを用いて、MIA PaCa-2（ヒト膵がん由来細胞株）中のSHMT1遺伝子をノックアウトした（ユーザー様提供データ）。

MIA PaCa-2細胞にgRNA（G1またはG2）とドナーDNA（D）をトランスフェクトし、8回継代した後、ピューロマイシン選択を行った。得られた安定細胞プールからゲノムDNAを抽出し、ゲノムPCRを行った。
ドナーDNA組込み部位の両隣にPCRプライマーをデザインし、ゲノム編集なしおよびindelが生じた場合は413 bpのPCR産物が、ドナーDNA組込みが生じた場合は1.6 kbのPCR産物が得られる。
コントロールは未改変のMIA PaCa-2細胞から抽出したゲノムDNA。
gRNA1（G1）を用いた安定細胞プールで、ドナーDNAの組込みが生じていることが示された。

0.4 kbのPCR産物をシークエンシングして、ノックアウト部位でのindelを確認したところ、A（アデニン）の挿入が確認された（両アレルについて、一方にドナーDNAの組込み、もう一方にindelが生じていることが確認された）。

Q-1. 標的遺伝子をノックアウトする際には、ドナーDNAは必要ですか？

A-1. ドナーDNAがないと、二本鎖切断は非相同末端結合（NHEJ：non-homologous end joining）によって修復され、予期せぬindel（挿入・欠失）が導入される傾向があります。そのため、標的遺伝子のフレームシフトを引き起こすような挿入・欠失についてスクリーニングをする必要があります。ドナーDNAに薬剤耐性遺伝子やGFP発現遺伝子を組込むことで、下流のスクリーニング手順を大幅に簡略化することができます。

Q-2. KN2.0 CRISPR Gene Knockout Kitによる遺伝子ノックアウトとドナー配列の標的遺伝子への組込みのメカニズムはどのようになっていますか？

A-2. KN2.0 Kitは、CRISPR-Cas9を用いた標的ゲノム編集技術をベースにデザインされています。標的遺伝子に特異的なgRNAがゲノムを切断し、選択カセットを含むドナーDNAが非相同末端結合（NHEJ：non-homologous end joining) を介した修復機構により切断部位に組込まれます。
ドナーDNAは、ゲノム中に順方向・逆方向のいずれかで組込まれるため、ドナーDNAに含まれる選択マーカー（ピューロマイシン耐性遺伝子）とレポーター遺伝子（GFP）を利用してスクリーニングを行います。
本キットを用いた遺伝子ノックアウトでは、多くの場合において1回のゲノム編集で両アレル（biallelic）をノックアウトします。そして、その多くの場合において、一方のアレルにドナーカセットが組込まれ、もう一方のアレルにはindel（挿入・欠失）が生じます。

Q-3. KN2.0 CRISPR Gene Knockout Kitの利点は何ですか？

A-3. 相同組換え（HDR）を介した遺伝子ノックアウト／ノックインは、手法が確立されていますが、HDR効率の低い細胞種や生物種では必ずしも適用できない場合があります。
KN2.0 Kitは、あらゆる細胞種や生物種に対する遺伝子ノックアウトのニーズに対して、普遍的な手段を提供するために特別に設計されており、ノックアウト効率が向上していることを確認済みです。

Q-4. KN2.0 CRISPR Gene Knockout Kitでの使用実績がある細胞は何ですか？

A-4. HeLa、HEK293T、MIA PaCa-2（ヒト膵がん由来細胞株）があります。

Q-5. KN2.0 CRISPR Gene Knockout Kitでピューロマイシン選択を行ったところ、生存細胞がありませんでした。この場合、どのような原因が考えられますか？

A-5. 2つの可能性が考えられます。
まず、その遺伝子が細胞生存に必須の遺伝子であるため、構成的な遺伝子ノックアウトに耐えることができないケースです。この場合は、コンディショナルノックアウトを行うが必要があります。
もう一つは、トランスフェクションの効率が低すぎるケースです。この場合は、トランスフェクションの最適化、またはエレクトロポレーション法などの別のトランスフェクション方法を選択する必要があります。

Q-6. KN2.0 CRISPR Gene Knockout Kitは、トランスジェニック動物モデル作製のための胚マイクロインジェクションに使用できますか？

A-6. KN2.0 Kitはトランスジェニック動物モデルを作製するための胚マイクロインジェクションに、理論上は使用することができます。しかしながら、OriGene社では未検証で、お客様自身での最適化が必要です。