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シングルセル単離・培養用マイクロ流路デバイス CellGem™シリーズ

掲載日情報：2021/10/27 現在Webページ番号：67201

オリジェムバイオテクノロジー /
OriGem Biotechnology Inc.
[メーカー略称：ORG]

CellGem™シリーズは、マイクロ流路を用いてシングルセルクローニングが行えるデバイスです。デバイス以外にFACSなどの専用の器具や、限界希釈法のような煩雑な手法を用いず、遥かに安価かつ同等の高効率でモノクローナル抗体の作製や安定発現細胞株の樹立が行えます。

※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

CellGemの外観図

CellGem™の外観図


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既存のシングルセルクローニング法との比較

単一の細胞を単離し、培養するシングルセルクローニングは、単一クローン由来の細胞株を樹立するために必須の手法であり、モノクローナル抗体の作製時のハイブリドーマ細胞株の樹立や、外部から導入した遺伝子を安定的に発現する細胞株の樹立などに用いられています。

伝統的な手法である限界希釈法は、大掛かりな機器を必要とせず、安価かつ精度の高い手法です。しかし、長時間の顕微鏡下での作業を必要とするため作業効率が低いうえに、大量のプレートと培地を用いるため多くの培養スペースが必要であるという問題がありました。また、FACSなどの専用機器を用いる方法は、高効率で単一細胞の単離が可能ですが、これらの専用機器は大型かつ非常に高額であり、加えて単離した細胞へのダメージが問題となることがあります。

一方、OriGem社で開発されたCellGem™は、ポリスチレン製マイクロ流路デバイスによって単一細胞の単離・培養を実現しています。CellGem™を用いた細胞の単離操作はピペット、ピンセット、遠心分離機、顕微鏡といった、ほとんどの研究室で保有している器具類で行えるため追加の機材を導入する必要はありません。単離効率も専用機器並みの高効率を実現しているため、限界希釈法と比較して培養を行うスペース、培地を節約することが可能です。さらに、価格の面でも専用機器に比べれば遥かに安価です。

実験方法使用器具使用スペースコスト実験者への負担その他のデメリット
CellGem™CellGem™チップ、顕微鏡、ピペットなどの一般培養器具CellGem™チップの周辺域程度限定的限定的（特になし）
限界希釈法大量のプレートと培地、ほか顕微鏡、ピペットなどの一般培養器具希釈操作を行うときにプレートを広げるため、かなりの作業スペースが必要器具・培地の代金顕微鏡下での確認作業が必要。手技が煩雑。作業に時間を要するため、細胞へダメージを与える可能性あり。
FACS など専用機器機器を設置するのに付帯する工事や設置スペースが必要初期投資、ランニングコスト限定的操作上、細胞へダメージを与える可能性あり。
シングルセルクローニングを行う際に必要となる培地とプレート数の比較

シングルセルクローニングを行う際に必要となる培地、プレート数の比較
左：CellGem™を用いた場合、右：限界希釈法を用いた場合


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原理

CellGem™デバイスの内部スペースには、細胞1つだけが入るごく微小なサイズのウェルと単離した細胞を培養するためのウェルが、図のように上下に向かい合う形で配置されています。
細胞を単離する際には単離用のウェルが下に来る向きにデバイスを置き、細胞懸濁液を注入することで、このウェルに重力により細胞（●または●）がトラップされます。その後、トラップされなかった細胞を洗い流してからデバイスを裏返すことで、トラップされた細胞が向かい側の培養用のウェルに落下し、そのまま培養に移ることができるという仕組みになっています。
培地の交換を行いながら培養を継続し、細胞が十分に増えてからデバイスを開封して細胞を回収することでシングルセルクローニングが完了します。CellGem™デバイスに配置されたウェルのうち70～80％が単一細胞を回収できることが確認されています（接着細胞、浮遊細胞を含む10種類の細胞での試験結果）。

CellGemによるシングルセルクローニングの仕組み CellGemによる各種細胞での使用実績

CellGem™によるシングルセルクローニングの仕組みと各種細胞での使用実績

CellGemによって単離された細胞と培養例

CellGem™によって単離された細胞と培養例

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アプリケーション

  • モノクローナル抗体の作製におけるハイブリドーマ細胞株の樹立
  • 外来遺伝子を恒常的に発現する安定発現株の樹立
  • 単一細胞レベルでの表現型解析および遺伝子発現解析

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製品内容・外観

単離したい細胞のサイズに応じてS（直径8～12μmの細胞向け）, M（直径11～17μmの細胞向け) , L（直径14～25μmの細胞向け)の3種類がラインナップされています。製品の付属物は下記のとおりです。

CellGemパッケージの内容物の画像
CellGem デバイスのウェル画像 CellGem デバイスの画像

①CellGem™ chip：1枚、3枚、6枚入りのパッケージがあります。

②Reservoirs：納品時にあらかじめデバイスに装着されています。使用前のデバイスの洗浄と細胞の注入に使用します。

③Sealing tape：②や④を取り外したあとにデバイスの蓋をするのに用います。生体適合性ポリオレフィン製です。

④Cell culture reservoirs：単離した細胞を培養する時にデバイス本体に装着し培地交換に用います。

⑤Disassembly tool：培養後の細胞回収時にデバイスを開封するのに用います。

⑥Tweezer：④を装着する部分のプラグを取り外すのに用います。

⑦Chip carrier：1枚入りおよび3枚入りパッケージでは1枚、6枚入りパッケージでは2枚が付属しています。

⑧Card for recording data：細胞を単離したあとにシングルセルになっているウェルを記録するのに用います。

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プロトコルの例・動画

以下に掲載するプロトコルは参考例です。用いる細胞種などによって最適な方法の検討を推奨いたします。

目的とする細胞種に適したCellGem™デバイスの選択

CellGem™には単離用ウェルのサイズに応じてS, M, Lの3種類のラインナップがあります。それぞれの製品と適合する細胞の例は以下の通りです。この表を目安として適切な製品をご選択下さい。

CellGem™のサイズ S M L
細胞サイズ（μm） 8～12 11～17 14～25
適用細胞種の例 CHO-K1,
AA8,
Jurkat		 U2OS,
NIH/3T3,
HEK293,
A549,
MCF-7,
L929,
EH7a		 ASC

細胞懸濁液の調製とデバイスの事前処理

1. 細胞を5×105～1×107 cells/mlの密度になるように懸濁する（2×106 cells/mlから検討するのがよい）。懸濁するバッファーや培地として以下の中から目的の細胞の凝集が起こらないものを用いる。

  • 1×PBS
  • 低血清／無血清培地
  • FACS sorting buffer
  • Cell dissociation buffer

2. 1 mlのPriming solution（30～35％エタノール）をデバイスに注入し、10～30秒間静置する。

3. 1 mlのPBSの注入・除去を3回行い、Priming solutionを置換する。デバイス中に気泡が残らないようにする。

単一細胞の単離と培養の準備

セルローディング

1. 500～600μlの細胞懸濁液をデバイスの片側から注入し、細胞が単離用のウェルに落下するまで3分間静置する。

細胞懸濁液をデバイスの片側から注入する図

2. 細胞を行き渡らせるためにデバイスの左右両方のReservoirsの注入口から100μlの1×PBSを加え、3分間静置する。顕微鏡観察を行い、空のウェルが多いようであればこの操作を繰り返す。

左右両方のReservoirsから注入する図

捕捉されなかった細胞の洗い流し

3. 1 mlの1×PBSを加え、ウェルに捕捉されなかった細胞を洗い流して除去する（洗い流された細胞は集めて再使用できる）。3分間静置。

捕捉されなかった細胞の洗い流し図

4. 上記の洗浄操作を繰り返し、顕微鏡で観察して、デバイス内に単離されなかった細胞が残っていないことを確認する。培地1～2 mlをピペットで両方のインレットポートに注入し、チップ内のPBSを細胞培養用メディアに交換する。

細胞培養用メディアに交換する図

5. リザーバー内の液体を完全に吸引した後、リザーバーをチップから取り外す。インレットポートにメディアを充填し、付属のシールテープでインレットをシールする。チップを裏返し、20分間放置して細胞を培養ウェルに自然に沈降させる。

チップを反転させる図

6. 培養湿度を維持するために、チップキャリアの両方のリザーバーにPBSを添加しふたをする。チップとチップキャリアを細胞培養インキュベーターに入れる。



細胞の培養

7. 1～2日培養した後（細胞が完全に付着した後）、ピンセット⑥でプラグを抜き、細胞培養用リザーバー④をチップに取り付け、新しい培地をゆっくりとチップに注入する。

細胞培養用リザーバー図

8. 細胞培養液をPBSで置換し、続いてPBSをTrypsinで置換する。37℃のインキュベーターで3分間インキュベートする。細胞培養用リザーバーを取り外し、付属の分解ツール⑤でデバイスを開封する。

PBSをTrypsinで置換図

9. 丁寧に内ふたをはがす。2μlピペットで細胞を回収し、適当な培養プレートに移す。

細胞を回収・移植する図

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CellGem™ Single Cell Culture, S（8～12μmの細胞向け）

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