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シングルセル単離・培養用マイクロ流路デバイス CellGem®シリーズ

掲載日情報：2021/10/27 現在Webページ番号：67201

オリジェムバイオテクノロジー /
OriGem Biotechnology Inc.
[メーカー略称：ORG]

CellGem®シリーズは、マイクロ流路を用いてシングルセルクローニングが行えるデバイスです。セルソーティングのように専用機器や、限界希釈法のような煩雑な手法を用いず、より簡便かつ低コストにモノクローナル抗体の作製や安定発現細胞株の樹立が行えます。

※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

CellGemの外観図

CellGem®の外観


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既存のシングルセルクローニング法との比較

単一の細胞を単離し、培養するシングルセルクローニングは、単一クローン由来の細胞株を樹立するために必須の手法であり、モノクローナル抗体の作製時のハイブリドーマ細胞株の樹立や、外部から導入した遺伝子を安定的に発現する細胞株の樹立などに用いられています。

伝統的な手法である限界希釈法は、大掛かりな機器を必要とせず、比較的低コストかつ精度の高い手法です。しかし、長時間の顕微鏡下での作業を必要とするため作業効率が低いうえに、大量のプレートと培地を用いるため多くの培養スペースが必要であるという問題がありました。また、FACSなどの専用機器を用いる方法は、高効率で単一細胞の単離が可能ですが、これらの専用機器は大型かつ非常に高額であり、加えて単離した細胞へのダメージが問題となることがあります。

一方、OriGem社で開発されたCellGem®は、ポリスチレン製マイクロ流路デバイスによって単一細胞の単離・培養を実現しています。CellGem®を用いた細胞の単離操作はピペット、ピンセット、顕微鏡といった、ほとんどの研究室で保有している器具類で行えるため追加の機材を導入する必要はありません。高い単一細胞捕捉効率を実現しているため、限界希釈法と比較して培養を行うスペース、培地を節約することが可能です。さらに、価格の面でも専用機器に比べればはるかに安価です。

実験方法使用器具使用スペースコスト実験者への負担その他のデメリット
CellGem®CellGem®チップ、顕微鏡、ピペットなどの一般培養器具CellGem®チップの周辺域程度比較的低コスト比較的少ない（特になし）
限界希釈法大量のプレートと培地、ほか顕微鏡、ピペットなどの一般培養器具希釈操作を行うときにプレートを広げるため、かなりの作業スペースが必要器具・培地の代金顕微鏡下での確認作業が必要。手技が煩雑。作業に時間を要するため、細胞へダメージを与える可能性あり。
FACSなど専用機器機器を設置するのに付帯する工事や設置スペースが必要初期投資、ランニングコスト比較的少ない操作上、細胞へダメージを与える可能性あり。

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原理

CellGem®デバイスの内部スペースには、細胞1つだけが入るごく微小なサイズのウェルと単離した細胞を培養するためのウェルが、図のように上下に向かい合う形で配置されています。
細胞を単離する際には捕捉用のウェルが下に来る向きにデバイスを置き、細胞懸濁液を注入することで、このウェルに重力により細胞（●または●）がトラップされます。その後、トラップされなかった細胞を洗い流してからデバイスを裏返すことで、トラップされた細胞が向かい側の培養用のウェルに落下し、そのまま培養に移ることができるという仕組みになっています。
培地の交換を行いながら培養を継続し、細胞が十分に増えてからデバイスを開封して細胞を回収することでシングルセルクローニングが完了します。CellGem®デバイスに配置されたウェルのうち、単一細胞捕捉効率は70～80％程度であることが確認されています（接着細胞、浮遊細胞を含む10種類の細胞での試験結果）。

CellGemによるシングルセルクローニングの仕組み CellGemによる各種細胞での使用実績

CellGem®によるシングルセルクローニングの仕組みと各種細胞での使用実績


CellGemによって単離された細胞と培養例

CellGem®によって単離された細胞と培養例

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アプリケーション

  • モノクローナル抗体の作製におけるハイブリドーマ細胞株の樹立
  • 外来遺伝子を恒常的に発現する安定発現株の樹立
  • 単一細胞レベルでの表現型解析および遺伝子発現解析

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製品内容・外観図

単離したい細胞のサイズに応じてS（直径8～12μmの細胞向け）、M（直径11～17μmの細胞向け）、L（直径14～25μmの細胞向け）の3種類がラインナップされています。製品の付属品は下記のとおりです。

CellGemパッケージの内容物の画像
CellGem デバイスのウェル画像 CellGem デバイスの画像

①CellGem® chip：1枚、3枚、6枚入りのパッケージがあります。

②Reservoirs：納品時にあらかじめデバイスに装着されています。使用前のデバイスの洗浄と細胞の注入に使用します。

③Sealing tape：②や④を取り外したあとにデバイスのフタをする際に用います。生体適合性ポリオレフィン製です。

④Cell culture reservoirs：単離した細胞を培養する時にデバイス本体に装着し培地交換に用います。

⑤Disassembly tool：培養後の細胞回収時にデバイスを開封する際に用います。

⑥Tweezer：④を装着する部分のプラグを取り外す際に用います。

⑦Chip carrier：1枚入りおよび3枚入りパッケージでは1枚、6枚入りパッケージでは2枚が付属しています。

⑧Card for recording data：細胞を単離したあとにシングルセルになっているウェルを記録する際に用います。

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製品ラインナップ

CellGem®には単離用ウェルのサイズに応じてS/M/Lの3種類のラインナップがあります。目的とする細胞種に適したCellGem®デバイスを選択する際は、以下の表を目安に適切な製品をご選択下さい。

CellGem®のサイズ S M L
適合細胞サイズ（直径）（直径） 8～12 μm 11～17 μm 14～25 μm
適用細胞種の例
  • CHO-K1
  • AA8
  • Jurkat
  • SP2/0-Ag14
  • A549
  • L929
  • EH7a
商品コード CellGemTS CellGemTM CellGemTL
CellGemTX＊
＊ 3サイズ（S、M、L）のデバイスを各1枚ずつセットにした製品です。

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操作方法概略

以下は、CellGem®を用いた単一細胞の捕捉、培養、回収の操作方法の一例です。用いる細胞種や培養条件に応じて、最適な条件を検討して下さい。

I. CELL CAPTURE

1.デバイスの事前処理

  1. 30～35％エタノールを1 ml、いずれかのインレットからゆっくり注入し、10～30秒間静置する。
    その後、エタノールをやや速く3回注入して気泡を除去し、チップ全体が溶液で満たされていることを確認する。
  2. PBSを1 mlずつ3回注入し、エタノールを完全に置換する。
  3. ※ 溶液を注入する際は、ピペットチップまたはシリンジ先端に気泡がないことを確認して下さい。気泡はチップの性能に影響する可能性があります。

2. セルローディング

  1. 細胞を十分に再懸濁し、細胞懸濁液を調製する。推奨濃度は1×106 cells/mlです。細胞懸濁液600 μlをチップに注入する。
  2. 3分間静置して細胞を捕捉ウェルに沈降させる。
  3. PBSを用いて一方のインレットから洗浄する。
  4. 続いて、反対側のインレットからPBSを用いて洗浄し、2分間静置する。
  5. ※ 上記の洗浄操作を繰り返し、これを1回分の細胞ローディング・洗浄工程とする。より良好な結果を得るために、この工程を2回行うことを推奨します。

3. シリンジによるチャンネル洗浄

  1. 5 mlのPBSを入れたシリンジをリザーバーに挿入し、1 ml/secの速度でPBSを注入する。同時に、ピペットまたは吸引装置を用いて洗浄液を吸引除去する。
  2. シリンジ内のPBSが残り約0.5 mlになったら、残りのPBSをリザーバーに加え、インレットポートが完全に覆われるようにする。
  3. 同様の手順で、もう一方のリザーバーも洗浄する。両方のリザーバーを洗浄した後、2分間静置する。
  4. 上記の操作を再度繰り返し、捕捉されていない細胞が残っていないことを確認する。
  5. 顕微鏡下で捕捉された細胞を確認する。捕捉効率が十分でない場合は、再度細胞をロードし、洗浄する。
  6. ※ チップの洗浄回数に制限はありません。捕捉されていない細胞を十分に除去するため、少なくとも2回洗浄することを推奨します。

4. 培地の充填、シーリングおよび反転

  1. チップ内のPBSを培地に置換するために、インレットから1 mlの培地を注入する。
  2. リザーバー内に残っている液体を完全に吸引した後、リザーバーをチップから取り外す。チップ表面の液体を拭き取り、インレットを培地で満たす。付属のシールテープでインレットをシールする。チップを180°反転させ、30分間静置して、細胞を自然に培養ウェルへ沈降させる。
  3. 培養中の湿度を維持するため、チップキャリア端部のリザーバーに2 mlの1×PBSを加え、ふたをする。Card for recording dataに単一細胞の位置を記録し、チップをセットしたキャリアを細胞培養インキュベーターに入れる。

Ⅱ. CELL CULTURE

培地交換用の細胞培養リザーバーを取り付ける

5. 細胞培養

  1. 1～2日間培養した後、細胞が十分に接着したことを確認し、細胞培養用リザーバーを取り付ける。
  2. ピンセットを用いてプラグを取り外す。ピンセットをインレットに垂直に挿入し、軽く圧力をかけて接続部を破断してから、プラグを引き抜く。
    ※ ピンセットを深く挿入しすぎて、底面のシールテープを突き破らないよう注意して下さい。
  3. 細胞培養用リザーバーをチップに取り付け、新しい培地をゆっくりとチップ内に注入する。
  4. 2～3日ごとに培地を交換する。一方のリザーバーに新しい培地を加えると、水圧差によってチップ内の培地がゆっくりと更新される。
  5. ※ チップ内に小さな気泡がある場合は、培地をゆっくりとチップ内に注入して気泡を除去して下さい。水圧差が生じない場合は、インレットポート周辺の気泡を除去し、リザーバーに培地を追加して下さい。

Ⅲ. CELL HARVEST

7～14日間培養した後、チップを分解して細胞を回収する。培養期間は細胞種により異なります。

6. 細胞回収

  1. 細胞培養用リザーバーを取り外す。
  2. Disassembly toolをチップ側面のDisassembly holeに挿入し、回転させてチップを開封する。まず短辺側を開き、続いて長辺側を開く。
  3. チップを開いた後、上部のTop cover layerを取り外す。チップをわずかに傾け、Middle soft layerを慎重にはがす。培養細胞を確認するか、培養細胞が存在するウェルを記録したCard for recording dataを参照して、各培養ウェルに1.5 μlのトリプシンを添加する。
  4. 2 μlピペットを用いて培養ウェルから細胞を吸引し、より大きな培養プレートへ移す。
  5. ※ 各培養ウェルの作業容量は1.5 μlです。

プロトコル動画



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使用文献

  1. Su, W. C., et al., J. Dent. Sci., 20(4), 2283-2291(2025). [PMID:41040584]
  2. Chen, H. H., et al., J. Dent. Sci., 19(1), 560-567(2024). [PMID:38303836]


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CellGem® Single Cell Culture, S（直径8～12 μmの細胞向け）

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細胞培養一般試薬