遺伝子発現調節（活性化／抑制）をレンチウイルスベクターの“all-in-one”システムで簡便に行えます Dharmacon CRISPRmod CRISPRa/i All-in-one Lentiviral sgRNA
掲載日情報：2023/06/14 現在Webページ番号：70493
“All-in-one”でCRISPRa/iによる遺伝子発現調節を簡便に！
触媒機能を不活性化させたdCas9と活性化因子またはリプレッサードメインの融合タンパク質と、sgRNAを単一で発現するレンチウイルスベクターにより、遺伝子発現調節を簡便に行うことができるシステムです。
※ Cas9とsgRNAを単一で発現するレンチウイルスベクターで遺伝子ノックアウトを行える Edit-R All-in-one Lentiviral sgRNAについてはこちらをご覧下さい。
※ Dharmacon製品（メーカー略称：DHA）につきまして、2023年4月1日より製品ご注文時にHandling Fee（手数料）を本体価格とは別にご請求させていただきます。詳細は「Handling Feeについてのご案内」をご確認下さい。
※ Horizon｜Dharmacon製品をご注文いただくには、事前にユーザー登録が必要です。ご注文方法の詳細は、こちらをご覧下さい。
※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。
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システムの違いについて
目的の遺伝子の転写を活性化したい場合、CRISPRmod CRISPR activation（CRISPRa）システムで標的遺伝子の転写が活性化された安定細胞株を簡便に樹立することができます。dCas9を3成分からなる活性化因子（VPR）と融合させたタンパク質と、プロモーター領域や転写開始部位（TSS: transcriptional start site）付近の配列を標的として設計されたgRNAを導入します。
目的の遺伝子の転写を抑制したい場合、CRISPRmod CRISPR interference（CRISPRi）システムで標的遺伝子の転写が抑制された安定な細胞株を簡便に樹立することができます。dCas9をリプレッサードメイン（SALL1およびSDS3）と融合させたタンパク質と、プロモーター領域や転写開始部位（TSS）付近の配列を標的として設計されたgRNAを導入します。
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特長
- 転写調節因子とdCas9の融合タンパク質と、sgRNAを発現する単一のレンチウイルスベクターという“all-in-one”のシステムで、効果的な遺伝子転写活性化、遺伝子転写抑制が可能です。
- 試薬を解凍後、細胞に加えるだけで細胞導入が行えます。トランスフェクションやエレクトロポレーションは不要です。
- 細胞の選択は、ピューロマイシン耐性遺伝子による細胞の選択、あるいはEGFPを用いた蛍光選択マーカーにより、ベクターの導入に成功した細胞を容易に選択することができます。EGFPは、蛍光が発現したらすぐにFACS解析を行うことができるため、標的細胞の迅速な濃縮に向いています。
- 各種のプロモーター（mCMVh、EF1α）が選択可能なため、お客様の細胞株で最も活性の高いプロモーターを選ぶことができます。
- CRISPRa/iによる遺伝子発現調節実験を初めて行われる研究者の方でも、簡素化されたワークフローで迅速に結果を得ることができます。
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遺伝子発現調節（活性化／抑制）のワークフロー
All-in-oneシステムを使用した遺伝子発現調節実験のワークフロー
遺伝子導入は、試薬を解凍し適量を細胞に加えるだけです。その後ピューロマイシンを用いて目的の細胞を選択するか、フローサイトメーター（FACS）を用いて濃縮することが簡単にできます。
ピューロマイシンセレクションを使用する場合：トランスダクション後24～48時間で増殖培地をピューロマイシンセレクション培地に置き換えます。その後、選択培地で正常に増殖するまで、細胞を毎日観察します。
EGFP蛍光レポーターオプションを使用する場合：遺伝子導入後72時間でFACSを用いて編集細胞を濃縮することが可能です。FACSによる濃縮ワークフローは、初代細胞のような短命の細胞タイプに特に有効です。
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使用例
All-in-one CRISPRa遺伝子転写活性化システムの使用例
All-in-one Puro-dCas9-VPRを使用したところ、効率的な転写の活性化が見られた。
HEK293T細胞あるいはHCT-116細胞を用いて実験を行った。
細胞を96ウェルプレートにそれぞれ20,000または5,000細胞／ウェルでプレーティングし、POU5F1、TTN、IL1R2を標的とするsgRNAを含むCRISPRa All-in-oneレンチウイルスまたはnon-targetingコントロールレンチウイルスを0.3 MOIで形質導入した。細胞はピューロマイシン（2.5 μg/μl）で選択し、5日間増殖させ、導入後2週間目に採取した後、RT-qPCRを用いて相対的な遺伝子発現を算出した。各遺伝子の相対発現は、ACTBをハウスキーピング遺伝子として∆∆Cq法で算出し、non-targetingコントロールに対して正規化を行い求めた。
All-in-one CRISPRi遺伝子転写抑制システムの使用例
ピューロマイシン選択により、転写抑制の改善が観察された。
U2OS細胞を96ウェルプレートに10,000細胞／ウェルでプレーティングし、PPIB、SEL1L、TFRCを標的とするsgRNAを含むCRISPRi All-in-oneレンチウイルスまたはnon-targetingコントロールレンチウイルスを0.3MOIで形質導入した。細胞はピューロマイシン（2.5 µg/µl、該当する場合）で5日間選択し増殖させ、形質導入後1週間または2週間後に採取した。相対的な遺伝子発現量は、ACTBをハウスキーピング遺伝子として∆∆Cq法で算出し、non-targetingコントロールに対して正規化を行い求めた。
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目的遺伝子の検索方法（例）
Horizon Discovery社の各製品のWebサイトにて、下記に示した入力フォーム"Start typing gene name" に目的の標的遺伝子名（例えばDNMT3Aなど）を記入し、右端の虫眼鏡のアイコンをクリックして検索を行って下さい。
※ 検索を行っているウェブページの下段にある入力フォームから、対象のRNA：CRISPRa All-in-one Lentiviral sgRNA Non-targeting Controls、CRISPRa All-in-one Lentiviral sgRNA Positive Controlsを選ぶことができます。
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ご注文方法
Horizon｜Dharmacon製品をご注文頂くには、事前にユーザー登録が必要です。
初めてご注文頂くお客様はユーザー登録・ご注文方法の詳細をこちらでご覧下さい。
ユーザー登録済みのお客様はID（メールアドレス）とパスワードで、Horizon Discovery社のWebサイトトップページでログインして、製品を検索・ご指定の上ご注文下さい。
※ Horizon Discovery社Webサイトの利用には、Google ChromeおよびSafariが推奨されています。
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製品ラインナップ
Dharmacon CRISPRmod CRISPRa All-in-one Lentiviral sgRNA
商品コードをクリックすると価格表をご覧いただけます。
| 製品フォーマット | 製品形態 | 選択マーカー | 包装 | 商品コード | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| プロモーター | 発現 | Human | Mouse | |||
| Individual | レンチウイルス粒子 （107 TU/ml） |
mCMV | EGFP | 100 μl | VSGH12394 | VSGM12400 |
| hEF1α | 100 μl | VSGH12418 | VSGM12424 | |||
| mCMV | PuroR | 100 μl | VSGH12554 | VSGM12388 | ||
| hEF1α | 100 μl | VSGH12406 | VSGM12412 | |||
| Set of 3 | レンチウイルス粒子 （107 TU/ml） |
mCMV | EGFP | 1 set（100 μl） | VSGH12397 | VSGM12403 |
| hEF1α | 1 set（100 μl） | VSGH12421 | VSGM12427 | |||
| mCMV | PuroR | 1 set（100 μl） | VSGH12557 | VSGM12391 | ||
| hEF1α | 1 set（100 μl） | VSGH12409 | VSGM12415 | |||
※ 指定した標的遺伝子により、商品コードの末尾には特定の数字が付きます。
Dharmacon CRISPRmod CRISPRi All-in-one Lentiviral sgRNA
商品コードをクリックすると価格表をご覧いただけます。
| 製品フォーマット | 製品形態 | 選択マーカー | 包装 | 商品コード | |
|---|---|---|---|---|---|
| プロモーター | 発現 | ||||
| Individual | レンチウイルス粒子 （107 TU/ml） |
mCMV | EGFP | 100 μl | VSGH12436 |
| 200 μl | VSGH12437 | ||||
| hEF1α | 100 μl | VSGH12448 | |||
| 200 μl | VSGH12449 | ||||
| mCMV | PuroR | 100 μl | VSGH12430 | ||
| 200 μl | VSGH12431 | ||||
| hEF1α | 100 μl | VSGH12442 | |||
| 200 μl | VSGH12443 | ||||
| Set of 3 | レンチウイルス粒子 （107 TU/ml） |
mCMV | EGFP | 1 set（100 μl） | VSGH12439 |
| 1 set（200 μl） | VSGH12440 | ||||
| hEF1α | 1 set（100 μl） | VSGH12451 | |||
| 1 set（200 μl） | VSGH12452 | ||||
| mCMV | PuroR | 1 set（100 μl） | VSGH12433 | ||
| 1 set（200 μl） | VSGH12434 | ||||
| hEF1α | 1 set（100 μl） | VSGH12445 | |||
| 1 set（200 μl） | VSGH12446 | ||||
※ 指定した標的遺伝子により、商品コードの末尾には特定の数字が付きます。
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