[CRISPR-Cas9]レンチウイルスによりCas9およびguideRNAを発現させるシステム Lentiviral CRISPR / Cas9 System

※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

Cas9（野生型または変異型）と、導入した任意のガイドRNAを一つのベクターで発現できるオールインワンシステムと、Cas9とガイドRNAをそれぞれのベクターで発現するシステムがあります。

Cas9とguide RNAを同時に発現するAll-in-oneタイプのレンチウイルスベクター

Cas9発現用レンチウイルスベクター

Cas9発現用レンチウイルスベクター（デュアルプロモータータイプ）

guide RNA発現用レンチウイルスベクター

GFP およびRFP を安定発現するHEK293T 細胞に、MSCV-Cas9-T2A-Puro（#CASLV120VA-1）およびEF1α-Blasticidin-H1-RFP gRNA（#CASLV500PA-B にRFP に対するgRNA 配列を挿入）を導入し、蛍光を観察した。

ヒトiPS 細胞をMSCV-hspCas9-EF1-copGFP レンチウイルス粒子（#CASLV125VA-1) で処理し、6 日間培養後、蛍光を観察した。

MCF-7 乳がん細胞をCMV-hspCas9-T2A-Puro レンチウイルス粒子（#CASLV100VA-1) で処理し、ピューロマイシンで10 日間培養後、顕微鏡で細胞の増殖を観察した。

Q-1. プレートにコロニーがほとんど生えません。

A-1. 以下の改善点が挙げられます。

1） 形質転換効率をが高いコンピテントセルを使用して下さい。
例：形質転換効率＞ 1 × 10⁹　CFUs/μg of pUC18 plasmid
2） プラスミドが損傷する可能性があるため、保存したプラスミドの凍結融解は行わないで下さい。プラスミドは、1 ～ 2 週間程度の短期間の冷蔵保存、または反応ごとに別チューブに分注し、－ 20℃での保存をお勧めします。
※ 上記の方法で解決できない場合は、当社テクニカルサポート（試薬担当）までお問い合わせ下さい。

Q-2. 1 種類の標的配列に対し、何種類のgRNA を設計すれば良いですか？

A-2. 作製したgRNA の切断効率の予測はできないため、最適な結果を得るために、2 種類以上のgRNA コンストラクトの作製をお勧めします。

Q-3. Cas9/Nickase 発現ベクターをパッケージングしたウイルスの力価が非常に低くなってしまいました。

A-3. 以下の点が原因として考えられます。

1） HEK293T 細胞の密度が高すぎる、または低すぎるため、トランスフェクション効率が低くなった可能性があります。トランスフェクションの際に、プレート中の細胞密度が50 ～ 80％になるように調節して下さい。
2） 293T 細胞の品質が悪かったため、偽ウイルス粒子の産生が不十分であった可能性があります。以下の点を参考に、生育条件の最適化を行って下さい。
・増殖培地を再確認して下さい。
・細胞の継代数が20 回以上でないことを確認して下さい。
・細胞がマイコプラズマ感染していないことを確認して下さい。
・ 細胞を増殖させすぎていないか確認して下さい（培養を対数増殖期に維持するため、細胞密度を90％以上にしないようにして下さい）。
3） 偽ウイルス粒子を含む細胞培養上清の回収タイミングが早すぎた、または遅すぎた可能性があります。培養上清は少なくとも2 度回収して下さい（トランスフェクション後48 時間および72 時間の時点）。回収した上清を合わせて、ウイルスの濃縮を行って下さい。PEG 沈殿によるウイルス粒子濃縮用試薬 PEG-it reagent(#LV810A-1, #LV825A-1）の使用をお勧めします。
4） 使用しているCas9/Nickase レンチベクターが、パッケージング効率の限界に近づいている可能性があります。
レンチウイルスシステムにおけるパッケージングでは、レンチベクターの5'LTR-3'LTR 間は8.5 kb までが限界です（Cas9/Nickase ベクターは8 kb までが限界）。cDNA インサートのサイズが2 kb 以上になると、パッケージング効率は著しく低下します（Cas9/Nickase ベクターでは、4 kb までのインサートサイズをパッケージング可能）。3 kb を組み込んだ場合は、1 kb の場合に比べ、パッケージング効率が1/10 以下になることがあります。これを回避するためには、パッケージングする細胞のプレート数を増やして、十分量のCas9/nickase ウイルスを得られるようにして下さい。

Q-4. Cas9/Nickase 安定発現細胞株を樹立し、gRNA をパッケージングさせたウイルス粒子を作製し、標的細胞に感染させましたが活性がありません。

A-4. 下記のような原因が考えられます。

1） 標的細胞での形質導入効率が低かった可能性があります。特定の細胞（初代細胞、幹細胞、浮遊細胞など）においては、形質導入は必ずしも高効率ではありません。そのような場合は、30 ～ 50の高い感染多重度（MOI）での感染や、Spin-Inoculation による強制的ウイルス感染をお勧めします。またT 細胞などの細胞型では、効率的な形質導入のために、G0 期から人工的に刺激を与える必要がある場合もあります。
2） gRNA のデザインにミスがあった可能性があります。設計上の規則に従って正確にオリゴDNA を合成したかどうか再確認して下さい。
3） 標的DNA 配列に変異の可能性があります。
標的DNA 配列に変異があった場合、gRNA 配列の認識に影響を与え、切断の失敗につながります。予め標的DNA 配列の変異の存在を知ることは難しいですが、もし何度も切断が失敗するようであれば、他のgRNA 配列を使用するか、gRNA 設計前に標的ゲノム配列の検証が必要です。
4） アッセイ前の時間の長さに問題がある可能性があります。DNA 標的の切断に際し、感染後最低でも72 時間経過後にアッセイを始めることを推奨しています。しかし、場合によっては、十分な切断の効果を見るため、感染後7 ～ 10 日間待った方が良いこともあります。

セーフハーバー（AAVS1）に対するガイドRNA、hspCas9（野生型）、Puromycin耐性遺伝子が組み込み済みのレンチウイルスベクター／レンチウイルス粒子です。

レンチウイルスやレトロウイルスのポリエチレングリコール（PEG）沈殿による濃縮を簡便に行える試薬
本製品100 ml で、400 ml のウイルス産生細胞の培養上清からレンチウイルスを濃縮できます。