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[CRISPR-Cas9]レンチウイルスによりCas9およびguideRNAを発現させるシステム Lentiviral CRISPR / Cas9 System

掲載日情報:2015/05/22 現在Webページ番号:53108

guide RNAによる新技術のゲノム編集ツール CRISPR-Cas9特集
レンチウイルスによりCas9およびguideRNAを発現させるCRISPR / Cas9システムです。
  • パッケージング済みのCas9発現用レンチウイルス
  • Cas9とguide RNAを同時に発現させるレンチウイルスベクター
  • Cas9とguide RNAをそれぞれ発現させるレンチウイルスベクター
の3種類の製品群をラインナップしています。

レンチウイルスベクターのウイルスパッケージングはLentiStarter 2.0 Kit (#LV051A-1)がお勧めです。
System Biosciences社では,本製品以外にも多数のCRISPR/Casシステム製品を取りそろえています。

レンチウイルス発現用CRISPR/Casシステム Lentiviral CRISPR/Cas9 System

レンチウイルス発現用CRISPR / Cas9システム製品ラインナップ

Cas9(野生型または変異型)と,導入した任意のガイドRNAを一つのベクターで発現できるオールインワンシステムと,Cas9とガイドRNAをそれぞれのベクターで発現するシステムがあります。

野生型ヒトCas9(hspCas9 wt)発現用
プロモーター マーカー Cas9発現用
レンチウイルスベクター
Cas9発現用
レンチウイルス粒子
All-in-one
レンチウイルスベクター
シングル CMV Puro CASLV100PA-1 CASLV100VA-1 CASLV300PA-1
MSCV Puro CASLV120PA-1 CASLV120VA-1 CASLV320PA-1
デュアル CMV EF1a copGFP CASLV105PA-1 CASLV105VA-1
MSCV EF1a copGFP CASLV125PA-1 CASLV125VA-1
変異型(D10A)ヒトCas9(hspCas9(D10A)mut,Nickase)発現用
プロモーター マーカー Cas9発現用
レンチウイルスベクター
Cas9発現用
レンチウイルス粒子
All-in-one
レンチウイルスベクター
シングル CMV Puro CASLV200PA-1 CASLV200VA-1 CASLV400PA-1
MSCV Puro CASLV220PA-1 CASLV220VA-1 CASLV420PA-1
デュアル CMV EF1a copGFP CASLV205PA-1 CASLV205VA-1
MSCV EF1a copGFP CASLV225PA-1 CASLV225VA-1
ガイドRNA(gRNA)発現用
プロモーター マーカー gRNA発現用
レンチウイルスベクター
デュアル EF1a H1 Blasticidin R CASLV500PA-B
EF1a H1 copGFP CASLV501PA-G
EF1a H1 RFP CASLV502PA-R
EF1a U6 Blasticidin R CASLV510PA-B
EF1a U6 copGFP CASLV511PA-G
EF1a U6 RFP CASLV512PA-R

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プラスミドマップ

Cas9とguide RNAを同時に発現するAll-in-oneタイプのレンチウイルスベクター

Cas9とguide RNAを同時に発現するAll-in-oneタイプのレンチウイルスベクター

Cas9発現用レンチウイルスベクター

Cas9発現用レンチウイルスベクター

Cas9発現用レンチウイルスベクター(デュアルプロモータータイプ)

Cas9発現用レンチウイルスベクター(デュアルプロモータータイプ)

guide RNA発現用レンチウイルスベクター

guide RNA発現用レンチウイルスベクター

■Cas9 Nuclease(D10A)とは
Cas9の変異体D10Aは,Nickaseとして機能することが報告されています*1。 Cas9(D10A)は,野生型Cas9のようにDNA二本鎖を切断せず,一本鎖のみを切断しニックを入れます。 そのため,二本鎖切断により引き起こされるDNA修復機構NHEJ(非相同末端再結合)が起こらず,望ましくない領域での遺伝子欠失・挿入やオフターゲット効果を抑制することができます*2。 また,最近ではペアのニックにより,細胞株におけるオフターゲット効果を50~1,500倍まで減少できた例が報告されています*3
*1Jinek, M., et al., Science, 17, 337(6096), 816~821 (2012).
*2Cong, L., et al., Science, 15, 339(6121), 819~823 (2013).
*3Ran, F. A., et al., Cell, 12, 154(6), 1380~1389 (2013).

[CRISPR-Cas9] RNAを細胞に導入するCas9-CRISPRシステム PrecisionX Cas9 SmartNuclease RNA System

図:標的部位のアンチセンス鎖に対するguide RNA 1とセンス鎖に対するguide RNA 2を作製し,Cas9(D10A)を用いてペアでニックを入れ,ゲノム編集の効率を向上させる。


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使用例

GFP およびRFP を安定発現するHEK293T 細胞に,MSCV-Cas9-T2A-Puro(#CASLV120VA-1)およびEF1α-Blasticidin-H1-RFP gRNA(#CASLV500PA-B にRFP に対するgRNA 配列を挿入)を導入し,蛍光を観察した。

GFP およびRFP を安定発現するHEK293T 細胞に,MSCV-Cas9-T2A-Puro(#CASLV120VA-1)およびEF1α-Blasticidin-H1-RFP gRNA(#CASLV500PA-B にRFP に対するgRNA 配列を挿入)を導入し,蛍光を観察した。

ヒトiPS 細胞をMSCV-hspCas9-EF1-copGFP レンチウイルス粒子(#CASLV125VA-1) で処理し,6 日間培養後,蛍光を観察した。

ヒトiPS 細胞をMSCV-hspCas9-EF1-copGFP レンチウイルス粒子(#CASLV125VA-1) で処理し,6 日間培養後,蛍光を観察した。

MCF-7 乳がん細胞をCMV-hspCas9-T2A-Puro レンチウイルス粒子(#CASLV100VA-1) で処理し,ピューロマイシンで10 日間培養後,顕微鏡で細胞の増殖を観察した。

MCF-7 乳がん細胞をCMV-hspCas9-T2A-Puro レンチウイルス粒子(#CASLV100VA-1) で処理し,ピューロマイシンで10 日間培養後,顕微鏡で細胞の増殖を観察した。

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FAQ

Q-1. プレートにコロニーがほとんど生えません。

A-1. 以下の改善点が挙げられます。

1) 形質転換効率をが高いコンピテントセルを使用して下さい。
例:形質転換効率> 1 × 109 CFUs/μg of pUC18 plasmid
2) プラスミドが損傷する可能性があるため,保存したプラスミドの凍結融解は行わないで下さい。プラスミドは,1 ~ 2 週間程度の短期間の冷蔵保存,または反応ごとに別チューブに分注し,- 20℃での保存をお勧めします。
上記の方法で解決できない場合は,当社テクニカルサポート(試薬担当)までお問い合わせ下さい。


Q-2. 1 種類の標的配列に対し,何種類のgRNA を設計すれば良いですか?

A-2. 作製したgRNA の切断効率の予測はできないため,最適な結果を得るために,2 種類以上のgRNA コンストラクトの作製をお勧めします。


Q-3. Cas9/Nickase 発現ベクターをパッケージングしたウイルスの力価が非常に低くなってしまいました。

A-3. 以下の点が原因として考えられます。

1) HEK293T 細胞の密度が高すぎる,または低すぎるため,トランスフェクション効率が低くなった可能性があります。トランスフェクションの際に,プレート中の細胞密度が50 ~ 80%になるように調節して下さい。
2) 293T 細胞の品質が悪かったため,偽ウイルス粒子の産生が不十分であった可能性があります。以下の点を参考に,生育条件の最適化を行って下さい。
・増殖培地を再確認して下さい。
・細胞の継代数が20 回以上でないことを確認して下さい。
・細胞がマイコプラズマ感染していないことを確認して下さい。
・ 細胞を増殖させすぎていないか確認して下さい(培養を対数増殖期に維持するため,細胞密度を90%以上にしないようにして下さい)。
3) 偽ウイルス粒子を含む細胞培養上清の回収タイミングが早すぎた,または遅すぎた可能性があります。培養上清は少なくとも2 度回収して下さい(トランスフェクション後48 時間および72 時間の時点)。回収した上清を合わせて,ウイルスの濃縮を行って下さい。PEG 沈殿によるウイルス粒子濃縮用試薬 PEG-it reagent(#LV810A-1, #LV825A-1)の使用をお勧めします。
4) 使用しているCas9/Nickase レンチベクターが,パッケージング効率の限界に近づいている可能性があります。
レンチウイルスシステムにおけるパッケージングでは,レンチベクターの5'LTR-3'LTR 間は8.5 kb までが限界です(Cas9/Nickase ベクターは8 kb までが限界)。cDNA インサートのサイズが2 kb 以上になると,パッケージング効率は著しく低下します(Cas9/Nickase ベクターでは,4 kb までのインサートサイズをパッケージング可能)。3 kb を組み込んだ場合は,1 kb の場合に比べ,パッケージング効率が1/10 以下になることがあります。これを回避するためには,パッケージングする細胞のプレート数を増やして,十分量のCas9/nickase ウイルスを得られるようにして下さい。


Q-4. Cas9/Nickase 安定発現細胞株を樹立し,gRNA をパッケージングさせたウイルス粒子を作製し,標的細胞に感染させましたが活性がありません。

A-4. 下記のような原因が考えられます。

1) 標的細胞での形質導入効率が低かった可能性があります。特定の細胞(初代細胞,幹細胞,浮遊細胞など)においては,形質導入は必ずしも高効率ではありません。そのような場合は,30 ~ 50の高い感染多重度(MOI)での感染や,Spin-Inoculation による強制的ウイルス感染をお勧めします。またT 細胞などの細胞型では,効率的な形質導入のために,G0 期から人工的に刺激を与える必要がある場合もあります。
2) gRNA のデザインにミスがあった可能性があります。設計上の規則に従って正確にオリゴDNA を合成したかどうか再確認して下さい。
3) 標的DNA 配列に変異の可能性があります。
標的DNA 配列に変異があった場合,gRNA 配列の認識に影響を与え,切断の失敗につながります。予め標的DNA 配列の変異の存在を知ることは難しいですが,もし何度も切断が失敗するようであれば,他のgRNA 配列を使用するか,gRNA 設計前に標的ゲノム配列の検証が必要です。
4) アッセイ前の時間の長さに問題がある可能性があります。DNA 標的の切断に際し,感染後最低でも72 時間経過後にアッセイを始めることを推奨しています。しかし,場合によっては,十分な切断の効果を見るため,感染後7 ~ 10 日間待った方が良いこともあります。



ウイルスベクター関連製品ご購入時のご注意
Cas9発現レンチウイルスはウイルスベクター関連製品のため,購入時にご使用者確認書が必要です。ご注文の際は,フナコシWebに掲載の「ウイルスベクター関連製品ご使用者確認書」に必要事項をご記入の上,販売店担当者にお渡し下さい。
なお,製品をご使用の際には「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律(カルタヘナ法)」および所属組織における安全管理規定に従い,しかるべき施設で実験を行って下さい。詳細は文部科学省ライフサイエンス課のホームページをご覧下さい。

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セーフハーバー(AAVS1)ノックイン用

セーフハーバー(AAVS1)に対するガイドRNA,hspCas9(野生型),Puromycin耐性遺伝子が組み込み済みのレンチウイルスベクター/レンチウイルス粒子です。

レンチウイルスによりCas9 およびガイドRNA(tracrRNA)を発現させるシステムです。

[在庫・価格 :2021年09月25日 00時14分現在]

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CMV-hspCas9-T2A-Puro-H1-AAVS1 gRNA SmartNuclease Lentivector Plasmid
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法規制等
保存条件 -20℃ 法規備考
掲載カタログ ニュース2020年5月15日号 p.8

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※ウイルスベクター関連製品のため,購入時に使用者確認書が必要です。
法規制等 カルタヘナ該当品
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Virus Precipitation Solution(5×), PEG-it
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(テクニカルサポート 試薬担当)

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