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安い・早い・高効率 CRISPR/Cas9による遺伝子改変マウス 作製受託サービス

掲載日情報:2019/08/05 現在Webページ番号:64354

guide RNAによるゲノム編集ツール CRISPR-Cas9特集

トランスジェニック社では,ゲノム編集技術(CRISPR/Cas9)による遺伝子改変マウスの作製受託サービスを提供しています。
新しいゲノム編集技術(CRISPR/Cas9)の出現は,遺伝子改変マウス作製にブレークスルーをもたらしたと言われています。効率が良い・作製が早い・費用が安いことが特長としてよく挙げられています。

特長

  • Broad研究所よりライセンス許諾を受けて実施しております。
  • Cas9ベクターあるいはCas9タンパク質を用いたインジェクションを実施しております。
  • 標的遺伝子に対するガイドRNA設計からin vitro活性評価も実施いたします。
  • ガイドRNAの設計から生体マウス作製まで,トータルサービスのご提供が可能です。また,一部工程のみの実施も可能です。
  • ドナーを用いたノックインも承ります。
  • 導入効率が高く,産子の50%以上に変異導入されることが期待できます。
  • 各種目的に応じたストラテジー相談から実施させていただきます。標的遺伝子によっては,本手法が実施できない場合もあります。その場合は別の作製方法を提案させていただきます。

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実施例

実施例

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これまでの作製方法との比較

これまでの作製方法との比較

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サービスの作業概要(標準工程)

1. guideRNA設計と活性確認

標的遺伝子に対してgRNA を設計し,その標的配列を認識・切断できるかどうか in vitro で切断活性評価を行います。
ご要望に応じて,Cas9発現ベクターの構築も実施いたします。

Cas9発現ベクターの作製

2. 受精卵へのインジェクション

既存のトランスジェニックマウス作製と同様の方法を用いて,Cas9 タンパク質とRNAの複合体を受精卵にインジェクションします。同時にドナーをインジェクションすることで,相同組換えによるノックインを期待します。
実施内容については,ご要望を踏まえご提案させていただきます。

Cas9発現ベクターをインジェクション

3. ファウンダーマウスの同定

変異が導入されている産子(ファウンダーマウス)をスクリーニングします。ダイレクトシーケンスによって変異体の検出を実施します。
これまでの結果から,産子の半数以上(2015年3月実績 約20系統の平均63%)に変異が導入されることが期待されます。

4. F1ヘテロマウスの取得

ファウンダーマウスのうち,目的通りの変異が導入されている個体を選択し,次世代(F1)マウスを作製します。
ファウンダーマウスはモザイク(変異が導入された細胞とされていない細胞が混在している)なので,次世代マウスに生殖系列伝播した個体を作出し,かつ変異を特定する必要があります。この工程で作出される次世代マウスは,ヘテロ(+/-)マウスです。
CF1ヘテロマウスの取得

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サービスの標準工程

工程 作業内容 納期
1. guide RNA設計と活性確認 guideRNAを設計します(in vitro での切断活性評価も含む)。 約1~2ヶ月
2. インジェクション
(C57BL/6N)
受精卵(C57BL/6系統)200個を用いて,
インジェクションを実施いたします。
約3ヶ月
3. ファウンダーマウスの導入変異解析 ダイレクトシークエンスによる導入変異の解析をいたします 約1ヶ月
合計   約5~6ヶ月

価格にはライセンス料を含んでいます。
ファウンダーマウス(F0)を作製します。
解析の結果,ファウンダーマウスが得られなかった場合,3.の費用はご請求致しません。
マウスの輸送費・微生物検査費は,別途申し受けます。

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サービスのオプション工程

工程 作業内容 納期
自然交配による
次世代マウスの作製
ファウンダーマウスと野生型マウスとの自然交配により,
次世代マウスを作製します。
産子全頭について,ダイレクトシーケンスによる導入変異の解析をいたします。
SPF施設の飼育ラック1棚を占有させ,1世代(3ヶ月間)の飼育・繁殖を行います。産子については,8週齢までの飼育とダイレクトシーケンスによる変異配列の解析を実施します。
1棚は10ケージを収納する規模です。交配・繁殖の進行に伴い,適宜,ケージ数を調整します。
妊娠出産に至らず産子が得られないときは,交配費用のみでの精算とさせていただきます。
約3ヶ月

上記の他,様々なストラテジー(ノックイン,floxマウス作製など)についても,ご相談を承ります。

CRISPR/Cas9の原理

CRISPR/Cas9の原理
  1. CRISPR/Cas9システムは,Cas9タンパク質とguide RNAから構成され,guide RNAの中の標的配列に相補的な20 merの配列が特異性を決めます。
  2. Cas9が導入された受精卵(あるいは細胞)では,guide RNAにより認識された標的遺伝子の配列が二重鎖切断(dsDNA break)されます。
  3. その切断部位が修復される過程で,塩基配列の欠失・挿入といった変異がゲノム上に導入されます。
    ドナーとなるDNA存在下では,相同組換えにより修復されます。
  4. 塩基配列の欠失・挿入では,フレームシフトによる標的遺伝子の破壊が起こります。
    また,相同組換えでは任意の変異導入が可能です。

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構築したCas9ベクターの切断活性(ガイドRNAの特異性)の評価方法

Cas9ベクターの切断活性の評価

標的とする遺伝子に対してガイドRNAを設計し,それをCas9ベクターに組み込むことで,その遺伝子配列を特異的に認識・切断できるCas9発現ベクターを構築いたします。また,ご要望によっては,mRNAでの操作も行います。

作製したCas9発現ベクターの切断活性(ガイドRNAの特異性)評価として,HEK293細胞にCas9ベクターと標的配列で分断されたGFP発現ベクターをコ・トランスフェクションします。Cas9による切断を受け,再構成されて発現するGFPをFACSで検出し,活性を評価します。
作業概要(標準工程 1.Cas9発現ベクターの作製)に含まれます。

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お客様のご要望に応じた工程での実施例(受精卵へのインジェクション)

Cas9ベクターあるいはCas9タンパク質と一緒にssOligo DNAを受精卵にインジェクションし,ポイントミューテーション(点変異)等をノックインしました。
これまでに、数塩基欠失,1塩基欠失,1塩基置換などの変異アレルを持つマウスを得ることに成功しております。

精卵へのインジェクション

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お客様のご要望に応じた工程での実施例 (ES細胞への導入)

ES細胞を用いて,相同組換え法との組み合わせにより,2箇所のloxP配列を挿入したコンディショナル・ポテンシャルのES細胞クローンを取得しております。

受精卵へのインジェクション

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お客様のご要望に応じた工程での実施例(高効率 CRISPR/Cas9 ノックイン法)

Cas9タンパク質とRNAおよびドナーを一緒に受精卵に導入することで,ゲノム中の特定の場所へノックインすることができます。
これまでは難しかった点突然変異の導入や大きなサイズの組換えを,受精卵で効率よく行うことが可能で,CRISPR/Cas9 によるマウス作製受託の適用範囲がさらに拡大するものと考えられます。

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CRISPR/Cas9のライセンス状況

トランスジェニック社は,2015年4月21日に米国Broad研究所からCRISPR/Cas9に関する特許群(US8,697,359B1他)の日本国内における非独占的実施権を取得しております(参考:ゲノム編集技術(CRISPR/Cas9)に関する非独占ライセンス契約締結のお知らせ)。
トランスジェニック社で受託作製した遺伝子組換えマウスは,お客様の機関内における研究目的での使用が認められています。
また,国立大学法人東京医科歯科大学より高効率 CRISPR/Cas9 ノックイン法に関する特許の日本国内での非独占的使用権許諾を受けております。

作製費用にはBroad 研究所および東京医科歯科大学へのライセンス料を含みます。

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