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in vivoで効率的にsaCas9を導入する組換えAAVベクター AAV-Cas9 SmartNuclease System

掲載日情報:2020/06/12 現在Webページ番号:65082

guide RNAによるゲノム編集ツール CRISPR-Cas9特集

様々なCRISPR/Cas9ゲノム編集システムと強力な組換えAAV(rAAV)技術を組み合わせ,最先端のin vivoのアプリケーションに適応できるゲノム編集システムです。saCas9は,広く使用されているspCas9よりもサイズが小さいながら同様の効率を持ち,rAAVベクターへの挿入が可能です。

特長

  • 出生後の動物のゲノム編集や,小動物モデルにおける遺伝子治療研究に有用です。
  • 新しい疾患モデルを作成できます。
  • All-in-oneベクターまたはtwo-vector AAV-Cas9ベクターからお選び下さい。

本製品に,ウイルス粒子を産生するためのパッケージングベクターは含まれていません。


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AAVによるCas9導入における問題点とsaCas9の発見

AAVは分裂・非分裂細胞の両方に遺伝子を導入し,長期間発現させる能力があるため,組換え体AAV (rAAV) は遺伝子治療やゲノム工学研究におけるベクターとして頻繁に使用されます。ただし,効率的にパッケージングを行うためにはAAVゲノムの2つのITR配列の間に挿入する配列は5 kb以下である必要があります。
CRISPR/Cas9によってゲノムに手を加える手法は既に開発し尽くされています。しかし,rAAVによるin vivoにおける遺伝子導入を行う際には,最も広く使用されるCas9であるStreptococcus pyogenes Cas9 gene (spCas9)のサイズが問題となっていました。この問題を克服するために,Ranらは,よりサイズの小さいCas9遺伝子オーソログの特性を解析し,Staphylococcus aureus 由来のCas9 (saCas9)を発見しました。saCas9はサイズがspCas9より1 kb程度短いにも関わらず,spCas9と同様の効率を持ち,rAAVベクターへの挿入が可能です。

参考文献

Ran, F. A., et al., In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9., Nature, 520, 186~191 (2015). [PMID: 25830891]

saCas9はspCas9と同様の効率を持つタンパク質ですが,gRNAデザインが以下の点において異なります。

  • saCas9の PAMとspCas9の PAMは配列が異なります。
  • saCas9は21 nt ~23 nt のgRNAsに対して最も効率的に働きます。

■saCas9 PAM sequences:
NNGGGT
NNGAAT
NNGAGT

■To create gRNAs, use the following:
Fwd-5.1: ACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN (N target sequence or gRNA sequence, 21 nts)
Rev-3.1: aaacXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX (X reverse complementary of N, 21 nts)

■Example:
aavs1 gRNA for saCas9: CTGTCCCTAGTGGCCCCACTG
sa-AAVS1gRNA-5.1 ACCGCTGTCCCTAGTGGCCCCACTG
sa-AAVS1gRNA-3.1 aaacCAGTGGGGCCACTAGGGACAG


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製品ラインナップ

AAV-Cas9 All-in-one vector

EF1a-hsaCas9-U6-gRNA(SA) All-in-one SmartNuclease AAV Plasmid(#CASAAV100PA-1)はsaCas9とgRNAを一つのベクターで発現できます。
gRNA配列を組み込み,ウイルスパッケージング後に,AAVanced AAV concentration reagent#AAV100A-1#AAV110A-1)を用いてウイルス粒子を濃縮してご利用下さい。

Anti-HIF1-alpha

[在庫・価格 :2021年09月25日 00時14分現在]

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EF1a-hsaCas9-U6-gRNA(SA) linearized all-in-one SmartNuclease AAV Plasmid(10tests)
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掲載カタログ ニュース2020年5月15日号 p.12

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EF1a-hsaCas9-U6-gRNA(SA) linearized all-in-one SmartNuclease AAV Plasmid(10tests)

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AAV-Cas9 Two-vector System

saCas9とgRNAを別々に導入するシステムです。EF1a-hsaCas9 SmartNuclease AAV Plasmid(#CASAAV200PA-1) とEF1-RFP-U6-gRNA(SA) SmartNuclease AAV Plasmid(#CASAAV300PA-1)の2種類のプラスミドをご用意下さい。gRNA発現ベクターにはEF1αプロモーターに連結された単量体のRFPマーカーが組み込まれており,赤色蛍光シグナルにより感染効率を確認できます。

saCas9とgRNAを別々に導入するAAV-Cas9 Two-vector Systemのベクターマップ

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EF1a-hsaCas9 SmartNuclease AAV Plasmid
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ニュース2019年5月15日号 p.15

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EF1-RFP-U6-gRNA(SA) linearized SmartNuclease AAV Plasmid(10tests)
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EF1a-hsaCas9 SmartNuclease AAV Plasmid

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EF1-RFP-U6-gRNA(SA) linearized SmartNuclease AAV Plasmid(10tests)

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使用例

■All-in-oneシステムとtwo-vectorシステムの比較
未成熟終始コドンの挿入によって不活性化されたGFP遺伝子を有したEnhanced Green Fluorescent Inhibited Protein (EGIP) レポーター細胞に対して,HRドナーと共に終止コドンを取り除くgRNAをデザインした。
gRNAの導入にはgRNA発現ベクターであるEF1-RFP-U6-gRNA(SA) (#CASAAV300PA-1,上段)またはAll-in-one saCas9 & gRNA AAV vector(#CASAAV100PA-1, 下段)を用いた。
AAV粒子を両方の細胞ライセートから単離し(左段),上清(右段)をHRドナーベクターと同時に細胞へ導入したところ,ゲノム編集が成功し,GFP発現が回復した。AAVプラスミド単体をHRドナーベクターと同時に導入した場合にも(中段),EGFP発現が回復し,ゲノム編集が成功したことが示された。


All-in-oneシステムとtwo-vectorシステムの比較

EGIPレポーター細胞を12ウェルプレートに1~1.5×106細胞播種し,HRドナーベクターと同時にAAV粒子に感染(左段,右段)またはAAVベクター(中段)をトランスフェクションした。感染・トランスフェクションの3日後もGFPの発現が見られ,ゲノム編集が成功していることが分かる。

上段:EGIPの欠損を修正するAAV-Cas9 two-vector system とドナーを導入した。
下段:AAV-Cas9 All-in-one systemとドナーをトランスフェクションした。

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関連製品:ワンステップでrAAV粒子を濃縮する試薬

パッケージング細胞培養培地に添加して一晩静置し,遠心分離(1500×g)を行うだけで高品質なrAAV(Recombinant adeno-associated virus,組換え体アデノ随伴ウイルス)粒子を濃縮できる試薬です。
従来のrAAV粒子濃縮方法とは異なり,細胞の溶解および塩化セシウム密度勾配超遠心,クロマトグラフィー,またはアフィニティーマトリックスカラムへの結合などの困難で時間がかかる複数の工程は不要です。

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AAVanced Concentration Reagent
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別包装品 別包装品あり
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保存条件 室温 法規備考
掲載カタログ ニュース2020年7月15日号 p.18

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AAVanced Concentration Reagent

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お問い合わせ先

(テクニカルサポート 試薬担当)

reagent@funakoshi.co.jp

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