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メーカー：	Horizon社Dharmacon製品 OriGene Technologies
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ワンステップでrAAV（組換えアデノ随伴ウイルス）粒子を濃縮する試薬 AAVanced Concentration Reagent

掲載日情報：2015/07/30 現在Webページ番号：63833

システムバイオサイエンス /
System Biosciences, LLC
[メーカー略称：SBI]

パッケージング細胞培養培地に添加して一晩静置し、1500×gで遠心するだけで高品質なrAAV（Recombinant adeno-associated virus、組換えアデノ随伴ウイルス）粒子を濃縮できる試薬です。
従来のrAAV粒子濃縮方法とは異なり、細胞の溶解および塩化セシウム密度勾配超遠心、クロマトグラフィー、またはアフィニティーマトリックスカラムへの結合などの困難で時間がかかる複数の工程は不要です。

※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

操作方法概略
特長
使用例
価格

操作方法概略

7×10⁶のHEK293細胞を、抗生物質を含まないDMEM, 10％FBSなどの完全増殖培地20 mlが入った150 mm²プレートに播種し、24時間以内に70～80％コンフルエントにする。
トランスフェクション試薬PureFection (#LV750A-1)を用いて、AAVシャトル、Rep/Cap、AAVヘルパーの各プラスミドを細胞に導入する。
トランスフェクションの翌日、培地を抗生物質を含んだ完全増殖培地に交換する。
トランスフェクションから72時間後、細胞培養上清を滅菌済み50 mlコニカルチューブに移す。AAVanced Concentration Reagentを培養上清に添加し、ピペッティングにより十分に混合する。
12時間～一晩冷却する。試料は4℃で4～5日間安定である。
4℃、1,500×gで30分間遠心する。AAV粒子はベージュまたは白色の沈殿となる。
上清を除き、沈殿に500μlの完全培地を加え1分間ボルテックスする。新しいチューブに移し、1,500×gで3分間遠心し、液体を吸引し完全に除去する。
冷却した滅菌済みのPBS、または4℃のDMEM含有25 mM HEPESで1:1000 (in vivo用)または1:100 (in vitro用)にウイルス粒子を再懸濁する。
使用するまで、-80℃で保存する。

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特長

1液組成で、操作が簡便です。
培地から直接rAAVを濃縮できます。
超遠心や細胞の溶解は不要です。
操作時間とコストを節約できます。
標準的なrAAVパッケージングプラスミドミックスに対応します。
形質導入する細胞への毒性はありません。

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使用例

AAVanced Concentration Reagentで濃縮したrAAV粒子の感染力

AAVanced rAAV Particles are Robustly Infective

PGKプロモーター下でGFPを発現するシャトルベクターをrAAVに導入し、従来法またはAAVanced Concentration ReagentによりrAAV粒子を濃縮した。それぞれ同量のrAAVをHEK293細胞に添加し、10日後にGFP発現細胞を観察した。

in vitroでのAAVanced Concentration Reagentを用いた様々なセロタイプのrAAV粒子の濃縮

AAVanced rAAV Isolation Works with Multiple Serotypes In Vitro

PGKプロモーター下でGFPを発現するシャトルベクターを3種類の異なるセロタイプ (AAV-2, AAV-DJ and AAV-5)のrAAVに導入した。細胞培養上清を48時間で回収し、AAVanced Concentration Reagentを用いてrAAV粒子を濃縮した。各rAAV粒子の沈殿を滅菌済みのPBS 100 ml中に再懸濁し、うち1 mlを3種類の異なる細胞株 (HEK293T、HT1080、CHO)に添加し6日後にGFP発現細胞を観察した。