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二本鎖切断(DSB)を伴わないゲノム編集が可能です Pin-pointTM塩基編集システム

掲載日情報:2023/11/29 現在Webページ番号:71018

Pin-pointTM塩基編集システムは、ニッカーゼnCas9のDNAターゲティング能力とシチジンデアミナーゼのDNA編集活性を利用し、Pin-point化学合成sgRNAと組み合わせて使用することで、標的点突然変異を導入します。

Pin-point塩基編集システムを構成する3つのコンポーネント

  • Pin-point nCas9 mRNA:DNAの一本鎖のみを切断または「ニッキング」するCas9からヌクレアーゼを欠損させた「ニッカ―ゼ」nCas9に、ウラシルグリコシラーゼ阻害タンパク質(UGI)を融合させたもの1
  • Pin-point Rat APOBEC mRNA:アプタマー結合タンパク質と融合したシチジンデアミナーゼ塩基編集酵素(Rat APOBEC)。シチジンデアミナーゼ酵素は、塩基対が編集ウィンドウ(プロトスペーサーのPAM遠位端の4から8位:下記概略図中で、デアミナーゼ(青)が結合している箇所)内にある場合、C-G塩基対をT-A塩基対に変換します2
  • Pin-point synthetic sgRNA:nCas9とアプタマー:デアミナーゼ融合体を特定のDNA標的部位に誘導するアプタマー性シングルガイドRNA(sgRNA)。

nCas9およびAPOBEC mRNAは、それぞれヒトにコドン最適化されており、5'および3'核局在化シグナル(NLS)を有しています。in vitroで転写後、CleanCap AGを用いてキャップ付加され、さらにポリアデニル化されています。これらのmRNAは導入した細胞中でタンパク質に翻訳された後、核に局在化します。

哺乳類細胞に3つの構成要素すべてを導入することで、標的部位のC-GからT-Aへの塩基変換が誘導されます。このシステムは、遺伝子ノックアウト(未成熟終止コドンの導入3、スプライスドナーおよびスプライスアクセプター部位の破壊4)、または点突然変異の導入に使用できます。


Pin-point塩基編集システムの概略図

Pin-point塩基編集システムの概略図
nCas9(薄い灰色)を利用することで、DNAの二本鎖切断が起こらず、DNA損傷応答経路を作動させません。Pin-point sgRNAにはアプタマー(緑)が含まれており、アプタマー結合タンパク質(オレンジ)を介してデアミナーゼ(青)をリクルートし、塩基編集を行います。

参考文献

  1. Komor, A.C., et al., "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage.″ Nature, 533(7603), 420(2016). PMID:27096365
  2. Collantes, J.C., et al., "Development and Characterization of a Modular CRISPR and RNA Aptamer Mediated Base Editing System.″ CRISPR J., 4(1), 58(2021). PMID:33616445
  3. Billon, P., et al., "CRISPR-Mediated Base Editing Enables Efficient Disruption of Eukaryotic Genes through Induction of STOP Codons.″ Mol. Cell, 67(6), 1068(2017). PMID:28890334
  4. Webber, B.R., et al., "Highly efficient multiplex human T cell engineering without double-strand breaks using Cas9 base editors.″ Nat. Commun., 10(1), 55(2019). PMID:31745080

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特長

  • DNAの二本鎖切断を伴わないゲノム編集が可能です。
    1. 意図しない突然変異のリスクが低いです。
    2. 染色体の切断による細胞毒性を起こすリスクを低減できます。

  • 高い編集効率を有します。
    1. 塩基編集により終止コドンの導入し、スプライス部位の破壊により高い効率で遺伝子KOを誘導します。
    (細胞の確率事象的なDNA修復機構による非相同末端結合のエラーと比較した場合)
    2. SNP編集や一塩基置換を高い効率で実現します。
    (ドナーDNAを用いた相同組換え法と比較した場合)

  • ガイドRNA(sgRNA)をカスタムオーダーできます。
    1. 複数の遺伝子に対して異なる位置にある複数の塩基の編集が可能です。
    2. 多様な変異体を作出することで、対象とする生物学的現象における標的遺伝子のアミノ酸レベルでの詳細な機能情報を得ることができます。

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ワークフロー

ワークフローの図
  1. 下記の3つのコンポーネントをエレクトロポレーションで細胞に導入する。
    ① Pin-point nCas9 mRNA
    ② Pin-point Rat APOBEC mRNA
    ③ Pin-point synthetic sgRNA
  2. 塩基編集を確認する。
    塩基編集を行った領域を増幅し、配列確認を行う。
  3. 表現型を分析する。

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アプリケーション例

  1. 遺伝子ノックアウトの作製/SNP改変
  2. 独自の同時ノックアウトとノックインの実証
  3. 複雑な細胞モデルのためのマルチプレックスなゲノム編集
  4. DNA損傷応答経路に感受性のある細胞の編集
  5. 遺伝子の機能的特性評価のための点変異生成
  6. RNAi、CRISPRi、従来のCRISPR-Cas9で行った実験に対する直交検証

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使用例

初代ヒトT細胞におけるマルチプレックスな塩基編集

活性化T細胞に、Pin-point mRNAと3つの標的(CD52、PDCD1、TRAC)に対するPin-point化学合成sgRNA、またはnon-targetingコントロール(NTC #1)sgRNAをそれぞれエレクトロポレーションした。Mockエレクトロポレーション(EP)細胞をネガティブコントロールとして使用した。エレクトロポレーション後6~7日目に細胞を回収し、PCR産物のPin-point解析用プライマーを用いたサンガー配列決定データから塩基編集レベルを算出した。
T細胞ドナー:N=8、独立した実験数:5、テクニカルレプリケート:二~三重試験。


初代ヒトT細胞におけるマルチプレックスな塩基編集の表現型解析

Pin-point塩基編集プラットフォームは、初代T細胞を効率的に多重遺伝子ノックアウトする。活性化T細胞に、3つの標的(CD52、PDCD1、TRAC)に対するPin-point mRNAおよびPin-point化学合成sgRNAをエレクトロポレーションし、7日後にフローサイトメトリーで解析した。PD1の発現を誘導するために、T細胞は48時間前にPMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)とイオノマイシンの存在下で培養した。CD52とTCRa/bの発現は非刺激細胞を用いて分析した。図は、塩基編集した試料およびモックエレクトロポレーション(EP)試料の、生細胞における各マーカー陰性細胞の割合を示す。
T細胞ドナー:N=2、テクニカルレプリケート:二~三重試験。


初代ヒトT細胞におけるマルチプレックスな塩基編集のフローサイトメトリーよる解析

塩基編集した試料とコントロール試料のおける3種類のマーカーのプロット。各マーカーの陰性細胞のゲーティングは生細胞で行った。


塩基編集によるトリプルノックアウトの編集効率

試料中の3つのマーカー(CD52、PD1、TCRa/b)が同時に陰性である細胞の割合。Pin-point塩基編集mRNAで編集した試料、およびモックエレクトロポレーション(EP)コントロールで、追加濃縮を行わず、生細胞における割合として示した。PD1の発現を誘導するため、3つのマーカーを同時に定量できるように、分析前にT細胞をPMA(phorbol 12- myristate 13-acetate)とイオノマイシンの存在下で48時間培養した。
T細胞ドナー:N=2、テクニカルレプリケート:二~三重試験。


トリプルノックアウト塩基編集のフローサイトメトリーゲーティング戦略

トリプル陰性の細胞数は生細胞数で正規化し、その割合を示した。右端のゲートの細胞数は、3つのマーカーすべてが陰性細胞。
左図:生細胞でゲーティングされたCD52陰性集団
中図:CD52陰性集団でゲーティングされたTCRa/b陰性集団
右図:CD52とTCRa/b二重陰性集団でゲーティングされたPD1陰性集団


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Pin-point mRNAおよびsgRNAの必要量

Pin-point mRNAの必要量

必要量ウェル/フォーマットサイズごとの反応数
HEK 293T細胞(96ウェルプレートで50,000細胞/ウェル)T細胞(24ウェルプレートで250,000細胞/ウェル)
Pin-point nCas9 mRNAPin-point Rat APOBEC mRNAPin-point nCas9 mRNAPin-point Rat APOBEC mRNA
1 μg/well0.1 μg/well1.56 μg/well0.22 μg/well
20 μg20回200回12回90回
100 μg100回1,000回1,000回450回
500 μg500回5,000回5,000回2,252回

Pin-point sgRNAの必要量

必要量ウェル/フォーマットサイズごとの反応数
HEK 293T細胞(96ウェルプレートで50,000細胞/ウェル)T細胞(24ウェルプレートで250,000細胞/ウェル)
60 pmol/wellSingleplex 20 pmol/well または
Multiplex (3 guides) at 20 pmol/well each
2 nmol33回100回
5 nmol83回200回
10 nmol166回500回

最適な結果を得るためには、各試薬の正確な量を、実験セットアップ、細胞タイプ、細胞数、プレートフォーマットごとに最適化する必要があります。


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