ホルモン、酸化ストレス、代謝関連因子、酵素活性測定キット DetectX アッセイキットシリーズ（Arbor Assays社）

Arbor Assays社は、ホルモン、酸化ストレス、代謝関連因子を含む広範な研究分野を対象とした高品質で利便性の高いアッセイキットの開発および製造を行っているメーカーです。Arbor Assays社の多彩なDetectXシリーズアッセイキットの製品ラインナップをご紹介いたします。

※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

測定因子名をクリックすると製品の概要をご覧いただけます。

品名をクリックすると製品の詳細、商品コードをクリックすると各製品の価格表をご覧いただけます。

下の各画像をクリックすると、それぞれの試料の前処理のプロトコルをご覧いただけます。

上の画像をクリックすると、メーカーウェブサイトの上記文献検索の画面が表示されます。

各項目（Search keywords/Species/Sample Type/Product）は、関連するキーワードがアルファベット順に並んだリストが表示されるほか、キーワード検索欄『Search』も用意されています。

※項目一つでも、複数の項目を組み合わせての絞り込み検索も行えます。

■ 検索例：コルチゾール（Cortisol）+ ゼブラフィッシュ（Zebrafish）

❶ Search keywordsで”Cortisol”を選択すると、該当する文献が表示される（文献数はSearch keywords、 Cortisol右側の（）内に表示される）。
❷ Speciesで”Zebrafish”を選択し、絞り込みを行う。。
❸ 下記の通り、該当の文献が表示される。
❹ 使用された製品名および詳細ページへのリンクも表示される。

Q-1. アッセイの測定感度と検出限界（LLD, Lower Limit of Detection）とは何ですか？

A-1.

• (a). 測定感度は、測定におけるバックグラウンドと統計的に区別することが可能なアッセイバッファー中の分析物の最低値であり、複数の低いスタンダードウェルとゼロのシグナルの比較によって決定された計算値です。測定感度は、最低濃度のスタンダードの測定値よりも高くなる可能性があります。試料の値が測定感度を下回っていた場合は、検出には低すぎると見なす必要があります。
• (b). LLDは測定感度に似ていますが、通常の試料の測定によって決定されます。複数の希薄な試料とゼロのウェルを比較し、ゼロと統計的に区別できる試料の最低濃度を決定します。

Q-2. スタンダードの範囲を変更できますか？

A-2. すべてのアッセイは、キットに添付されているマニュアルに示されているスタンダードの範囲において、正確で再現性のある結果が得られるようにテストおよび設計されています。その範囲よりも高いまたは低い測定点の追加は、アッセイのパフォーマンスを改善しない場合があります。スタンダードの濃度を変更すると、重要な測定点（アッセイポイント）で適切なデータが得られず、不正確になる可能性があります。また、測定に使用されている抗体とバッファーの関数である感度の限界があることも忘れないで下さい。曲線の下限の標準濃度を追加するだけでは、測定感度は上がりません。標準曲線の推奨する希釈方法に従うことにより、通常の場合、最良の結果を得ることができます。

Q-3. 試料をアセチル化する必要があるのはなぜですか？

A-3. サイクリックヌクレオチド用のすべてのDetectXキット（cAMP Kit（#K019-Hおよび#K019-C）、およびcGMP Kit（#K020-Hおよび#K019-C））には、スタンダードと試料のアセチル化に使用できる試薬が付属しています。これらのキットの特異的な抗体は、アセチル化されたヌクレオチドに対してより反応性が高いため、この方法で試料を処理することによりcAMPまたはcGMPのより高感度な測定が可能になります。ただし、アセチル化について注意点がいくつかあります。まず、アセチル化試薬により試料中のタンパク質と脂質が沈殿します。測定濃度に合わせて希釈した試料のみを処理する必要があります。
第二に、アセチル化はプロセスに別のステップを追加します。一般には、最初はアセチル化せずに試料を測定することをお勧めします。通常のアッセイは非常に感度が高く、ほとんどの試料はアセチル化の手順を実施せずに分析できます。試料濃度が低すぎる場合、またはマトリックスの干渉を排除するために試料を非常に希釈する必要がある場合は、アセチル化は測定で良好な結果を得るための有用なツールになります。

Q-4. 4PLカーブフィッティングを使用する必要があるのはなぜですか？

A-4. 競合法における検量線のシグモイド形状は、4パラメーターロジスティックモデル（4PLC）によって最も正確に適合します。線形、指数、または両対数などの代替モデルでは、特に高濃度と低濃度で不正確な測定値が得られます。市販のほとんどのプレートリーダーには、検量線の4PLC法を使用してデータを適合させる機能があります。不明な場合、プレートリーダーの製造元にお問い合せ下さい。また、Arbor Assaysのすべてのキットにおいて、無料のデータ分析ソフトウェア「MyAssays」を提供しています。

Q-5. CLIAとELISAの利点は何ですか？

A-5. 化学発光アッセイ（CLIA）は、通常同じマーカーの比色アッセイ（ELISA）よりも感度が高くなります。例えば、cAMP ELISA Kit（#K019-H1 / H5）の測定感度は5 fmolですが、cAMP CLIA Kit（#K019-C1 / C5）の測定感度は1 fmolです。CLIAアッセイには、光学密度の比色測定値とは異なり、アッセイからのグロー発光の測定が可能なプレートリーダーが必要となります。

Q-6. GSH測定用に試料を準備するにはどうすればよいですか？

A-6. Glutathione Detection Kit（K006-FおよびK006-H）について多くの質問を受けています。これらのアッセイでは、試料中のGSHを定量化するために使用される検出器が試料に存在する遊離チオール基とも反応します。このため、タンパク質またはその他の潜在的な干渉成分を最初に除去する必要があります。これは、すべての試料を5％の5-スルホサリチル酸二水和物（SSA）で処理することにより、より大きなタンパク質を沈殿させ、一方でグルタチオンは溶液中に残存します。遠心分離後、試験前に上清を回収し、Assay bufferで最大1％SSAに希釈することができます。Fluoescent Kit（#K006-F）では、還元型GSHと酸化型GSSGを同じウェルで測定することができます。Colorimetric Kit（#K006-H）では、試料とスタンダードを2-ビニルピリジン（2VP）（還元型グルタチオン（GSH）が検出器と反応するのを防ぐ化学物質）で処理することにより、存在する還元型GSHとは別に、酸化型グルタチオン（GSSG）を測定することが可能です。2VP未処理の同じ試料から個別に決定された総GSHの濃度より酸化GSHの濃度を差し引くことにより、遊離GSH濃度を決定することができます。

Q-7. 解離試薬を使用する必要がありますか？

A-7. 解離試薬は、試料タンパク質へのいくつかのホルモンの結合を最小限に抑えるために、一部のステロイドおよび他のAssay Kitに付属されています。これらの試料のステロイドは、担体タンパク質と関連しており、アッセイで検出できないため、血清または血漿試料でのみ使用する必要があります。唾液、糞便、尿などのマトリックス中の試料では、解離試薬を必要としません。
ステロイド分析物のほとんどのアッセイには、血清および血漿試料の処理に使用する必要がある特別な解離試薬が付属しています。この試薬は、測定のためにステロイドが循環中に結合する特殊な結合タンパク質やアルブミンなどの他の担体からステロイドを解放します。解離試薬自体からマトリックス干渉を排除するために、血清および血漿試料を解離試薬で処理後に試験前に試料をアッセイバッファーでさらに希釈する必要があります。希釈方法については、各キットのマニュアルをご確認下さい。

Q-8. 試料の最適希釈率を決定するにはどうすればよいですか？

A-8. 最初にPubMedで同様の研究を調べて、正常レベルをご判断下さい。測定結果における試料の干渉を最小化するために、検証済みのほとんどの試料タイプの推奨希釈率の最適化を行っています。リストされていない試料タイプを測定する場合は、最初にそのタイプに関するデータがあるかどうかを確認するためにお問い合せ下さい。それ以外の場合では、直線性とスパイク試料の希釈実験を実行し、どの希釈が線形結果をもたらすかを判断する必要があります。

Q-9. マトリックス干渉とは何ですか？

A-9. 測定物質に加え、多くの試料にはタンパク質や脂質などの別の要素が含まれているため、標的物質とキット内の特定の抗体との結合が妨げられる可能性があります。検量線のウェルでは、純粋な分析対象物が単にアッセイバッファーに溶解されるため、干渉する可能性のある成分は存在しません。測定を実行すると、試料のウェルとスタンダードのウェルに同量の測定物質が含まれているが、試料のウェル内の別の成分が特定の抗体への結合を妨げる状況が発生する場合があります。その結果、これらのウェルでは測定物質の量が同じであっても異なる量のシグナルを生成します。

Q-10. 未検証の生物種とは何ですか？

A-10. ステロイド（コルチコステロンなど）、環状ヌクレオチド（cAMPおよびcGMP）、または小さな脂質（PGE₂、PGFMなど）などの多くの測定物質は、由来に無関係でまったく同じです。したがって、特に試験されていない生物種由来であっても、ELISAまたはCLIAで使用可能なはずです。さらに、Glutathione S-Transferase Kit（#K008-F1）またはPKA Kit（#K027-H1）などの試料の活性を測定するキット、または抗体を使用せずに測定物質の存在を検出するキット（Nitric Oxide Kit（#K023-H1）またはHemoglobin Kit（#K013-H1））は、生物種固有の相互作用によって制限されないためにあらゆる生物種の試料で機能します。これらのカテゴリに分類されるすべてのキットは、「Multi Species」として表示されます。検証済みの特定の生物種に限定されているキットには、Cystatin C Human Immunoassay Kit（#K012-H1）など、品名に生物種の名前が含まれています。

Q-11. 未検証のタイプの試料を使用することはできますか？

A-11. キット開発中に特に試験されていないほとんどのタイプの試料は機能しますが、試験と最適化が必要になります。マトリックスの干渉を排除するために、試料を希釈する必要がある場合や、抽出する必要がある場合があります。試料の測定値が検量線の範囲内に収まるようにするための最適な希釈率も決定する必要があります。試料のマトリックスの干渉を避ける十分な希釈後に測定値が検量線の測定範囲に収まる場合、または試料を抽出し測定物質が許容量回収できる場合において、最終的にそのタイプの試料も機能します。

Q-12. ELISAまたはにおける、NSB、B0、およびzero standardとは何ですか？

A-12.

• NSB（Non-specific binding）：競合ELISAにおいて非特異的に結合したペルオキシダーゼ標識物からのシグナルを表します。このシグナルは、プラスチック自体に保持されたペルオキシダーゼ標識物と、基板からのバックグラウンドシグナルから生成されます。
• B0（Binding for zero standard, maximum binding well）：競合ELISAまたはCLIAにおいて特異的抗体によって捕捉された酵素からの最大シグナルを表します。他のすべてのスタンダードと試料は、この値のパーセンテージとして表されます。
• Zero Standard (Background signal for sandwich assay）：イムノアッセイの測定における最小シグナルを表し、検量線の一部になります。

Q-13. Extraction solutionとは何ですか？いつ使用する必要がありますか？

A-13. 小さなペプチドを測定するキットの一部には測定に使用できない試料の精製に使用できる抽出溶液（X123）が付属しています。この酸性有機溶媒溶液は、タンパク質やその他の干渉物質を沈殿させますが、測定物質は溶液中に残存します。汚染物質を含む可能性のある試料はすべて処理できますが、Oxytosin Kit（#K048-H、K048-C）、Arginine-Vasopressin Kit（#K049-C）、またはET-1 Kit（#K045-H1）では、血清、血漿、唾液の抽出操作が必要となります。
試料調製には、1容量の試料を1.5容量のExtraction reagentと混合し、ボルテックスしてから90分間混合します。混合物を1,660gで20分間遠心分離した後、上清を別のチューブに移し、SpeedVacで乾燥させます。この時点で、試料はキットに付属のAssay bufferで再構成し測定できます。必要に応じて、C18固相カラムを使用して試料を抽出することもできます。詳細は、Arbor Assays社アッセイキットデモビデオおよび試料別前処理プロトコルを併せてご参照下さい。