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FRET法による2',3'-cGAMP測定キット(Arbor Assays社) DetectX 2',3'-Cyclic GAMP STING-Based FRET Detection Kit

掲載日情報:2022/01/14 現在Webページ番号:70168

試料中の2',3'-Cyclic Guanosine monophosphate-adensosine monophosphate(cGAMP)を蛍光(FRET)法により高感度に定量するキットです。in vitroにおいて試料中の2',3'-Cyclic GAMP濃度をリアルタイムで測定することができ,ハイスループットスクリーニングにも最適です。


検量線例

標準曲線1

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DetectX 2',3'-Cyclic GAMP STING-Based FRET Detection Kit(#K081-F

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cGAMPとは

cGAMPの役割

2', 3'-サイクリックグアノシン一リン酸-アデニル酸一リン酸(cGAMP,2',3'-Cyclic Guanosine monophosphate-adensosine monophosphate)は,Ⅰ型インターフェロン(IFN)の応答調節により自然免疫に関与するセカンドメッセンジャーです1。細胞の細胞質に二本鎖DNAがある場合,2',3'-cGAMPシンターゼ(cGAS, 2', 3'-cGAMP synthase)はDNA活性化cGASに結合し,ATPとGTPから2',3'-cGAMPを産生します。次に,cGAMPは拡散してSTING(Stimulator of interferon genes)に結合し,cGAS-cGAMPSTING経路を完成させます1~4。STINGが環状ジヌクレオチド(CDN, Cyclic dinucleotides)を検出すると,TBK1-IRF3およびNFκB経路を誘導し,Ⅰ型インターフェロンおよびサイトカインの産生をを引き起こします。それにより病原体の検出,代謝調節,自己免疫,およびがんに関与します5~8

cGAMPのFRETベースのバイオセンサーへの応用

親和性は低いものの,STINGは2', 3'-cGAMPや他のCDNに結合します。これにより,cGASが侵入性病原体のDNAを検出する必要なく細菌のCDNを直接識別することができます9~11。STINGは2', 3'-cGAMPに自然結合することから,Pollockらにより生細胞内で2',3'-cGAMPをリアルタイムで検出する蛍光共鳴エネルギー移動(FRET,Fluorescence Resonance Energy Transfer)ベースのバイオセンサー(BioSTING)が開発されました。FRETは,2つのフルオロフォア間のインスタンス依存関係に基づく蛍光検出プラットフォームです。BioSTINGの場合では,mTFPとmKO2がフルオロフォアとして最適です。mTFPは,458 nmの波長で励起され,リガンド(2',3'-cGAMP)が存在しない場合には発光は490 nmで検出されます。BioSTINGがリガンドに結合すると,2つのフルオロフォアが互いに近接して配置され,蛍光がmTFPからmKO2に転移されることにより発光波長が600 nmに変化します。このBioSTINGは,CDN産生調節におけるin vitroハイスループットスクリーニングやSTINGアゴニストとアンタゴニストのダイレクトスクリーニングに適用することが可能です12

参考文献

  1. Ishikawa, H., et al., "STING is an endoplasmic reticulum adaptor that facilitates innate immune signalling", Nature, 455, 674~678 (2008).[PMID:18724357]
  2. Wu, J., et al., "Cyclic GMP-AMP is an endogenous second messenger in innate immune signaling by cytosolicDNA", Science, 339(6121), 826~830 (2013).[PMID:23258412]
  3. Sun, L., et al., "Cyclic GMP-AMP synthase is a cytosolic DNA sensor that activates the type I interferon pathway", Science, 339(6121), 786~791 (2013).[PMID:23258413]
  4. Zhou, W., et al., "Structure of the Human cGas-DNA Complex Reveals Enhanced Control of Immune Surveillance", Cell, 174(2), P300~311 (2018).[PMID:30007416]
  5. Zhang, C., et al., "Structural basis of STING binding with and phosphorylation by TBK1", Nature, 567, 394~398 (2019).[PMID:30842653]
  6. Liu, S., et al., "Phosphorylation of innate immune adaptor proteins MAVS, STING, and TRIF induces IRF3 activation", Science, 347(6227),aaa2630 (2015).[PMID:25636800]
  7. Oliveira, M.C., et al., "Modular Architecture of the STING C-Terminal Tail Allows Interferon and NF-κB Signaling Adaptation", Cell Rep., 27(4), P1165~1175 (2019).[PMID:31018131]
  8. Cai, X., et al., "The cGAS-cGAMP-STING Pathway of Cytosolic DNA Sensing and Signaling." Molecular Cell, 54(2), P289~296 (2014).[PMID:24766893]
  9. Shang, G., et al., "Cryo-EM structures of STING reveal its mechanism of activation by cyclic GMP-AMP", Nature, 567, 389~393 (2019).[PMID:30842659]
  10. Burdette, D., et al., "STING is a direct innate immune sensor of cyclic di-GMP.", Nature, 478, 515~518 (2011).[PMID:21947006]
  11. Wang, C., et al., "Synthesis of All Possible Canonical (3'-5'-Linked) Cyclic Dinucleotides and Evaluation of Riboswitch Interactions and Immune-Stimulatory Effects", J. Am. Chem. Soc., 139(45), 16154~16160 (2017).[PMID:29056046]
  12. Pollock, A., et al., "A STING-based biosensor affords broad cyclic dinucleotide detection within single living eukaryotic cells", Nat. Commun., 11(1), 3533 (2020).[PMID:32669552]

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特長

  • 測定試料:細胞ライセート,組織抽出物,組織培養液
  • 測定原理:FRET
  • 測定方法:蛍光
  • 測定波長:励起 458 nm,蛍光 490 nm/600 nm
  • 測定時間:15分
  • 測定範囲:131~500 nM
  • 感度:82.02 pmol/ml

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交差性

ヌクレオチド 交差性(%) ヌクレオチド 交差性(%)
2',3'-cGAMP 100 cAMP <0.01
2',3'-c-di-AMP2(Synthetic) 73.35 AMP <0.01
2'2'-cGAMP(Synthetic) 34.03 cGMP <0.01
3'3'-cGAMP(Bacterial) 25.92 GMP <0.01
c-di-AMP 16.04 ATP <0.01
c-di-GMP 4.04 GTP <0.01

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キット内容

  • 2',3'-Cyclic GAMP standard
  • DetectX BioSTING protein concentrate
  • Assay buffer concentrate
  • Black 96 well plate
  • Plate sealer

測定には蛍光プレートリーダーが必要です。

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Arbor Assays社アッセイキットデモビデオ

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2', 3'-cGAMP STING-Based FRET Detection Kit(96well)
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お問い合わせ先

(テクニカルサポート 試薬担当)

reagent@funakoshi.co.jp

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