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生体液試料からセルフリーDNA / RNAを精製するキット Quick-cfDNA/cfRNA Serum & Plasma Kit

掲載日情報:2020/06/12 現在Webページ番号:68075

3 mlまでの血清,血漿などの各種生体液試料から,高品質のセルフリーDNA(cfDNA)およびセルフリーRNA(cfRNA)を簡便かつ確実に精製できるキットです。cfDNA,cfRNAの個別精製または共溶出の2種類のプロトコルを選択できます。
血液試料中のcfDNA(セルフリーDNA)やcfRNA(セルフリーRNA)を室温(15~25℃)で7日間保存することができるプラスチック製の血液保存用チューブについてはこちらをご覧下さい。
本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。


cfRNAの収総量

図1:ヒト血漿からのcfRNA精製の例
本キットおよび他社キット2製品を用い,同一ドナーの血漿からそれぞれのプロトコルに従ってcfRNAを精製し,30μlで溶出した。
A:得られたセルフリーsmall RNAの総量をQubit microRNA Assay Kit(Thermo Fisher Scientific社)で定量した。本キットで得られたcfRNAの収総量が試料量に比例している。

B:得られたcfRNA中のmiR-16-5pの量を,Busk, P. K.氏の手法(BMC Bioinformatics, 2014)で,RT-qPCRにより定量した。
本キットで得られた個別のmiRNAの収量が試料量に比例していることおよび,その収量が他社キットの最大515倍であることが示された。


セルフリー核酸のバイオマーカーとしての利用について

血清,血漿試料中に含まれるセルフリー核酸(cfNA)は,セルフリーDNA(cfDNA)およびセルフリーRNA(cfRNA)からなり,その主な由来は以下の2つとなります。ひとつは各種組織においてアポトーシスまたはネクローシスを起した細胞の溶解時に放出されたもので,もうひとつはエキソソームなどの微小小胞体として分泌された粒子中に含まれるものです。後者は遠く離れた細胞との情報伝達に用いられています。

胎児由来の血漿中cfDNA検出は遺伝病の出生前遺伝子検査に用いられ,大きなインパクトをもたらしました。この検査は,従来の羊水穿刺と比較して極めて容易かつ母親と胎児の双方に安全です。この成功をきっかけとして,がんの検出や進行のモニタリングに使用できる新たなバイオマーカーを血漿中cfDNAから探索する試みが進められています。

しかし,cfNAの利用には未だ課題があります。第一に検出に必要な量のcfNAを得るためには多量の試料を必要とします。第二に高濃度の血漿タンパク質の存在と,ほとんどのcfNAの分子量が小さいことにより不純物の除去および効率的なcfNA回収が困難となっています。第三に次世代シークエンシング(NGS)やqPCRを含めた現行のcfDNAバイオマーカー検出プロトコルには,改善すべき箇所が多くあります。特に,現在のNGSライブラリー構築法ではcfDNAとcfRNAを分離精製する必要があります。

Zymo Research社のキットは高品質のcfNAを簡便かつ確実に精製でき,さらにはcfDNA,cfRNAの個別精製,共溶出の2種類のプロトコルを選択できるため,cfNA研究の促進に有用な製品です。


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特長

  • タンパク質結合型の核酸,エキソソーム由来核酸,miRNA,その他のsmall RNAを含む循環セルフリーDNA(cfDNA)およびセルフリーRNA(cfRNA)を,Zymo-Spinテクノロジーにより超高純度に得られます。
  • 有害なフェノール,クロロホルムの使用や,煩雑なタンパク質の沈殿・除去操作は行いません。
  • 革新的な結合システムを用いており,競合品と比べて515倍のmiRNAが得られた実績があります(図1参照)。
  • 最大3 mlの試料まで,精製核酸は試料量に対して直線性高く得られます(図1参照)。
  • 精製したcfDNAおよびcfRNAは,RT-qPCR,次世代シークエンシング(NGS)を含む各種アプリケーションに,直ちに使用できます。

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仕様

溶出液量15μl(収量最大にする場合)
6μl(高濃度溶出を行う場合)
溶出液DNase / RNase-free water
精製可能な試料最大3 mlの血清,血漿,脳脊髄液,羊水,尿,その他各種生体液
得られる核酸のサイズ50 bp(DNA),≧17 nt(RNA
収 量cfDNA,cfRNAそれぞれについて1~100 ng/ml(ヒト血清,血漿の場合)
得られる核酸の純度RT-qPCR,次世代シークエンシング(NGS)を含む各種アプリケーションに使用可能な純度
操作時間30分(cfDNAとcfRNAを共溶出する場合)
45分(cfDNAとcfRNAを個別精製する場合)
Proteinase K処理に別途2時間を要する

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操作方法概略

操作方法概略

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使用例

各種生体試料からの精製例

図2:各種生体試料からの精製例
羊水(AF),脳脊髄液(CSF),HeLa細胞の培養液(Media)から本キットを用いてセルフリー核酸を精製した。
左:得られた核酸中のmiR-16-5pの量を,Busk, P. K.氏の手法(BMC Bioinformatics, 2014)で定量した。
右:それぞれの試料から得られたセルフリー核酸をTapestation 2200 (Agilent社)でキャピラリーゲル電気泳動解析した。



各種生体試料からの精製例 各種生体試料からの精製例

図3:ヒト血漿からのcfDNA,cfRNAの個別精製と共溶出の例
同一ドナー由来のヒト血漿に下記の核酸をそれぞれ添加(Spike-in)した後,本キットのcfDNA,cfRNA個別精製/共溶出それぞれのプロトコルで核酸を精製した。

A:ヒト血漿にセンチュウmiRNA(cel-miR-39-3p)を添加後,精製を行った。得られた核酸中のcel-miR-39-3pをRT-qPCRで定量した。
cfTotal:共溶出プロトコル
cfDNA-only,cfRNA-only:それぞれの個別精製プロトコル
グラフの縦軸はcel-miR-39-3pのコピー数(二重試験の平均値を対数表示),横軸の+/-は,cel-miR-39-3p添加の有無を意味する。
cfRNA個別精製/共溶出のいずれでも添加したmiRNAの80%以上が回収されていることと,cfDNA画分へのmiRNA混入が0.003%以下であることが示された。

B:ヒト血漿に100 bp DNAラダーを添加後,精製を行った。得られた核酸をTapeStation(Agilent社)でキャピラリーゲル電気泳動解析した。
cfTotal:共溶出プロトコル
cfDNA-only,cfRNA-only:それぞれの個別精製プロトコル
Spike-in:添加した100 bp DNAラダー
cfDNA個別精製/共溶出のいずれでも添加した100 bp DNAラダーが効率的に回収されている。cfDNAの大部分が100~240 bpのサイズであるため,本キットがcfDNA精製に適していることが示された。
また,cfRNA画分へのDNA混入が検出限界以下であった。このことにより,本キットで精製したcfRNAが,RNA-Seq用ライブラリーの構築に適していることが示された。


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製品の比較例

製品の比較例(クリックで展開します)

表1

キット名ドナー
(年齢,性別)
総リード数フィルターのパスhg38へのアライメントmiRNA Baseへのアライメント5リード以上読めたmicroRNAの数
リード数リード数の割合(%)リード数リード数の割合(%)リード数リード数の割合(%)
Zymo Research社キット39F7,916,8947,058,14689.154,730,49459.754,727,72559.72470
61F6,076,4245,224,76885.982,965,30548.802,903,82047.79377
50M7,507,8027,224,05196.225,765,84276.805,719,72176.18367
B社キット39F6,200,1692,366,81438.17234,7353.795990.0110
61F6,277,7292,585,42241.51356,9825.738400.0116
50M5,764,6203,365,36658.38296,4535.146980.0111
A社キット239F6,803,9736,039,43388.76265,0603.908750.0113
61F10,000,1748,255,08982.55403,9534.041,2950.0116
50M7,425,8876,491,40487.42347,6094.682,9690.0420
A社キット139F6,332,8794,020,30563.482,109,09833.301,881,82829.72400
61F7,348,5722,998,44140.80937,72612.76769,49810.47287
50M7,574,5555,316,76770.193,358,26744.343,015,69039.81344

図4

NGS比較1

図5

NGS比較2

表1/図4/図5:各種キットにより精製したcfRNAを用いたRNAシークエンシングの結果(HiSeqシステム使用)
ドナー3人由来の血漿200μlから4種類のキットを用いてcfRNAを精製した。得られたcfRNAをRealSeq-Biofluids Library Prep Kit (SomaGenics社)を用いてRNAシークエンシング用ライブラリーを構築後,HiSeq 1500 v4 System (Illumina社)で解析し,リード数とリードの品質をまとめた(表1)。Zymo Research社キットで精製したcfRNAは,他社キットで精製したcfRNAと比べて,使用可能なリードが平均で4~44%高いことが示された。
また,hg38(ヒトゲノムデータベース,32~57%,図4左)およびmiRNA Base(microRNAデータベース,35~61%,図4右)に対して,他社キットの場合よりも極めて高くアライメントできることが示された。
さらに,Zymo Research社キットで精製したcfRNAは,他社キットで精製したcfRNAと比べて,miRNAの割合が高いことが示された(図5)



表2

キット名ドナー総リード数リード数の割合(%)microRNAの数
フィルターをパスhg19へのアライメントmiRNA Baseへのアライメント検出できた5リード以上読めた10リード以上読めた
Zymo Research社キット11,195,83767.286.544.2601307236
21,252,92783.791.637.3775420330
3562,87671.784.448.7399182138
41,154,65583.992.844.2717382310
平均値1,041,57476.688.843.6623323254
A社キット111,092,13570.567.30.92328649
2951,59164.167.50.31445125
3775,41460.761.70.31594530
4801,47138.661.50.31042313
平均値905,15358.563.90.41605129

図6

NGS比較3

図7

NGS比較4

表2/図6/図7:各種キットにより精製したcfRNAを用いたRNAシークエンシングの結果(MiniSeqシステム使用)
ドナー4人由来の血漿200μlから2種類のキットを用いてcfRNAを精製した。得られたcfRNAをRealSeq-Biofluids Library Prep Kit (SomaGenics社)を用いてRNAシークエンシング用ライブラリーを構築後,MiniSeq System (Illumina社)で解析し,リード数とリードの品質をまとめた(表2)。Zymo Research社キットで精製したcfRNA(76.6%)は,A社キットで精製したcfRNA(58.5%)と比べて,リード品質の平均が高いことが示された。
また,hg19(ヒトゲノムデータベース,88.8%対63.9%,図6左)およびmiRNA Base(microRNAデータベース,43.6%対0.4%,図6右)に対して,A社キットよりも高くアライメントできることが示された。
さらに,Zymo Research社キットで精製したcfRNAは,A社キットで精製したcfRNAと比べて,miRNAの割合が高いことが示された(86%対13.9%,図7)。


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キット内容

各キットコンポーネント名をクリックすると,単品の価格表をご覧いただけます。


本製品を用いたcfDNA/cfRNAの抽出,精製(Spin-Away Filterへの結合ステップ)にはEZ-Vac Vacuum Manifold(#S7000)の使用を推奨します。

EZ-Vac Vacuum Manifold

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価格

[在庫・価格 :2021年01月18日 23時08分現在]

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Quick-cfDNA/cfRNA Serum & Plasma Kit
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血清,血漿などの各種生体液試料から,高品質のセルフリーDNA(cfDNA)およびセルフリーRNA(cfRNA)を簡便かつ確実に精製できるキット。cfDNA,cfRNAの個別精製,共溶出の2種類のプロトコルを選択できる。
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掲載カタログ ニュース2020年1月合併号 p.15
ニュース2019年2月1日号 p.11

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Quick-cfDNA/cfRNA Serum & Plasma Kit

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説明文 血清,血漿などの各種生体液試料から,高品質のセルフリーDNA(cfDNA)およびセルフリーRNA(cfRNA)を簡便かつ確実に精製できるキット。cfDNA,cfRNAの個別精製,共溶出の2種類のプロトコルを選択できる。
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掲載カタログ ニュース2020年1月合併号 p.15
ニュース2019年2月1日号 p.11

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■ キット別売品

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お問い合わせ先

(テクニカルサポート 試薬担当)

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