アポトーシス検出キット特集

プログラム的に制御された細胞死である「アポトーシス」の検出キット（アッセイキット）特集です。アポトーシスの検出方法には、DNA断片化の検出、細胞膜構造変化の検出、ミトコンドリア膜電位消失の検出、カスパーゼなどのアポトーシス関連酵素活性の検出などがあります。各種アポトーシス検出キット（アッセイキット）をご紹介します。
細胞死は主に、アポトーシス（プログラム的に制御された細胞死、Programmed Cell Death、PCD）と、ネクローシス（事故的な細胞死、Accidental Cell Death、ACD）に分かれます。
※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

アポトーシスに伴って起こるクロマチンDNAのヌクレオソーム単位での断片化は、アポトーシスに特徴的な指標です。
断片化されたDNAの検出には、DNAラダーをアガロースゲル電気泳動により検出するコメットアッセイ（CometAssay）や、アポトーシス過程で生じる断片化DNAの末端を特異的に標識し、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、フローサイトメーターなどを用いて検出する方法（TUNEL法）などがあります。

アポトーシスに伴って断片化されたDNAの検出例画像（CometAssay Kit）

正常な細胞では、細胞膜の内膜と外膜でリン脂質に偏りがあります。ホスファチジルセリンなどの陰イオン性リン脂質は細胞膜の内膜に局在していますが、アポトーシスの初期段階では膜構造が変化し、細胞外膜上に露出します。
こうした膜構造の変化の検出には、露出したホスファチジルセリンにCa²⁺ 存在下で特異的に結合するタンパク質（Annexin V）が用いられます。ネクローシス細胞では膜構造が完全に崩壊し、Annexin Vの結合は内膜にも及びますが、アポトーシス細胞ではAnnexin Vは外膜のみに結合します。外膜に結合したAnnexin Vを検出することで、アポトーシス細胞を検出します（Annexin V結合アッセイ）。
この膜構造の変化は、DNA断片化やクロマチン凝縮に先行して起こり、アポトーシス初期の検出に有用です。

細胞膜構造の変化とAnnexin Vの結合図
アポトーシスの初期に細胞膜構造が変化し、正常細胞では脂質二重膜の内側に存在するホスファチジルセリンが細胞膜の外側に露出する。
その陰性荷電したリン脂質にCa²⁺ 依存的にAnnexin Vが結合することを利用してアポトーシス細胞を検出する。

ミトコンドリア膜電位の消失は、ミトコンドリア膜上に局在するBaxの活性化により引き起こされ、ミトコンドリアの膜に穴が空き、ミトコンドリア膜電位が低下すると考えられています。
その結果、シトクロムcやアポトーシス誘導因子（Apoptosis Inducing Factor、AIF）が細胞質中に漏出し、アポトーシス特異的なプロテアーゼであるカスパーゼを活性化してアポトーシスを進行させます。
一方、ミトコンドリア膜電位消失を防ぎ、アポトーシス抑制に働く因子としてBcl-2やBcl-XLが知られています。
ミトコンドリア膜電位の低下を検出するためには、ミトコンドリア膜透過性の陽イオン性蛍光試薬を用いて、蛍光強度や蛍光色の違いを観察する方法が一般的です。
一例として、JC-1は生細胞ではミトコンドリアに取り込まれて赤色蛍光を発しますが、アポトーシスを起こした細胞ではミトコンドリアに取り込まれず細胞質中で緑色蛍光を発するため、アポトーシスを検出できます。

Jurkat細胞を2.5 μg/mlのstaurosporineで2時間処理し、JC-1により染色した例
staurosporine未処理の細胞は赤色を呈しているが（左）、staurosporine処理細胞はミトコンドリア膜電位差が低下し、ほとんどの細胞が緑に染色されている（右）。

カスパーゼ（Caspase） はアポトーシスシグナル伝達において中心的な役割を果たすシステインプロテアーゼです。
哺乳類では少なくとも14種類のカスパーゼファミリーに属する分子の存在が明らかになっています。カスパーゼは活性の低い前駆体（pro-Caspase）として細胞内に存在し、細胞死刺激を受けるとプロセシングされて活性型となります。
アポトーシス誘導時にはカスパーゼファミリーにより形成されるプロテアーゼのカスケードが活性化され、細胞質または核内の基質を切断し、細胞の形態的、生化学的変化を引き起こします。カスパーゼは、他のカスパーゼを切断し活性化する、カスパーゼカスケードを引き起こします。アポトーシスシグナル伝達では、イニシエーターカスパーゼ（カスパーゼ-2、-8、-9、-10）を活性化します。イニシエーターカスパーゼは、さらに下流のエフェクターカスパーゼ（カスパーゼ-3、-6、-7）を活性化します。エフェクターカスパーゼは、最終的に標的タンパク質を切断してアポトーシスを引き起こします。炎症関連カスパーゼ（カスパーゼ-1、-4）は、サイトカインを活性化し、炎症を誘導すると考えられています。損傷したミトコンドリアから漏出されたシトクロムcは、Apaf-1（Apoptosis Protease-Activating Factor 1）と結合し、イニシエーターカスパーゼ（カスパーゼ-9）を活性化することで知られています。
カスパーゼ活性の測定法としては、細胞抽出液中にカスパーゼ特異的基質を加え、その切断活性を調べる方法が一般的です。

哺乳類のカスパーゼ（Caspase）ファミリーのホモロジー

アポトーシスとネクローシスを識別するキット、ELISA系ベースのアポトーシス検出キット、シトクロムc測定キットなどがあります。
シトクロムcは、アポトーシスの過程でミトコンドリアから放出され、Apaf-1（Apoptosis Protease-Activating Factor 1）と結合し、イニシエーターカスパーゼ（カスパーゼ-9）を活性化することで知られています。

ハムスター肺線維芽細胞の染色によるアポトーシスとネクローシスとの識別（APOPercentage Apoptosis Assay Kit）