アポトーシス細胞の染色／細胞増殖アッセイ／ミトコンドリア関連アッセイキット Cell Health and Viability Assay Kitシリーズ（Cayman Chemical社）

アポトーシス（Apoptosis）は非炎症性の分子イベントの連鎖であり、細胞体積の減少、核の断片化、クロマチンの凝縮、DNAの分解、細胞膜のブレッビング、そしてアポトーシス小体への分散などの形態変化を引き起こします。アポトーシスの刺激や経路の違いにより、実験条件に影響を受ける細胞死（Cell Die）の関連性を特定することが重要です。

アポトーシスでは、ミトコンドリア内膜のプロトン勾配の電位が低下し、☞ ミトコンドリアの透過性遷移孔（mPTP：Mitochondrial Permeability Pore）が開き、シトクロムcなどのアポトーシス因子が放出されます。ミトコンドリア膜電位の消失は、アポトーシスの初期段階と考えられることもあれば、アポトーシスシグナル伝達経路の結果とされることもあります。ミトコンドリア膜電位を評価する簡単な方法は、JC-1やTMREなどの正電荷を持つ色素を用いることです。

JC-1は、正常なミトコンドリアでは凝集すると赤色の蛍光を発し、アポトーシスなどにより膜電位が失われると緑色の蛍光を発します。膜電位が低下し脱分極したミトコンドリアはTMREを蓄積できず、分極したミトコンドリアにTMREが蓄積することから、生細胞内のミトコンドリア膜電位の変化をモニタリングするのに適しています。

カスパーゼ（Caspase）は、細胞外デスリガンド（FasL（Fasリガンド）やTNF-αなど）が細胞外デスレセプター（Extracellular death ligand）に結合し、イニシエーターカスパーゼ8（Initiator caspase-8）を動員すると、外因性経路を介して活性化されます。

カスパーゼ3およびカスパーゼ7のプロテアーゼ活性は、特定の蛍光基質N-Ac-DEVD-N'-MC-R110を用いて検出でき、切断により蛍光生成物を生成します。

核の断片化は、カスパーゼによる核ラミナの分解と核膜の崩壊によって起こります。アポトーシスの特徴として、クロマチンの凝縮とDNAの断片化が挙げられます。Hoechst 33342色素は、核の凝縮を顕微鏡で確認するために使用されます。アポトーシスでは、ゴルジ体、小胞体、ミトコンドリアも断片化し、細胞膜のブレブに分散されます。

Hoechst色素は細胞透過性があり、生細胞や固定細胞の核酸に結合します。青の発光スペクトルを持ち、複数の蛍光色素を使用する研究者に便利です。代替の細胞透過性DNA色素としてDRAQ5があり、青からオレンジの蛍光色素と多重化できます。膜非透過性色素には、ヨウ化プロピジウム、DAPI、DRAQ7、RedDot2があり、膜の完全性が損なわれた死細胞の核を特異的に染色するのに適しています。

細胞骨格の弱体化により、細胞質は細胞膜で支持されない領域に押し付けられます。ブレブと呼ばれる膜突起は、ミオシン依存性のアクチン皮質束の収縮によって細胞質が細胞皮質に押し付けられ、細胞骨格が劣化した領域にブレブが生じて形成されると考えられており、顕微鏡で観察できます。膜ブレッビングは、アポトーシス細胞がより小さなアポトーシス小体に分裂するための重要なステップです。

アポトーシスの初期段階では、アポトーシス細胞は“find-me”シグナルを分泌して貪食細胞を動員し、貪食細胞が認識可能な“eat-me”シグナルを掲示します。このアポトーシス細胞と貪食細胞間の選択的相互作用によって特異的に標的化された死につつある細胞（dying cells）は非炎症性除去（non-inflammatory clearance）されます。食細胞を動員する“find-me”シグナルには、リゾホスファチジルコリン、スフィンゴシン-1-リン酸、フラクタルカイン、およびATPやUTPなどのヌクレオチドなどがあります。細胞膜のパネキシン1（plasma membrane pannexin 1、PANX1）チャネルは、カスパーゼ媒介チャネルの開口を介して、“find-me”シグナルを放出します。カスパーゼ依存性PANX1チャネルの開口によってTO-PRO-3などの蛍光モノマーシアニン色素が進入可能となるために、パネキシンチャネル機能を利用して“find-me”シグナルを発している細胞を特定することができます。

TO-PRO-3は、アポトーシスの開始の初期のイベントを検出できる遠赤色蛍光色素であり、カスパーゼ依存的に活性化される選択的パネキシンチャネルを介して細胞に入ります。そのため、従来のアポトーシスマーカー（アネキシン V （Annexin V）など）が非検出で生存可能と見なされる可能性のある細胞をアポトーシスの初期細胞として識別できます。

食細胞がアポトーシス細胞に引き寄せられると、リン脂質二重層の内側から外側にホスファチジルセリンとホスファチジルエタノールアミン残基を細胞表面に露出します。この再配置でアポトーシス細胞を生存細胞とは異なるものとして特定され、食細胞が異物細胞を食べるサインとなります。アポトーシス細胞の外膜上のホスファチジルセリンを調べるために、アポトーシス中に露出したホスファチジルセリン残基に付着するリン脂質結合タンパク質のアネキシンVを用いて“eat-me”フェーズが特定されます。

さまざまな蛍光色素（FITC、PE、APC など）を結合したアネキシンV（Annexin V）を用いて、アポトーシス細胞の外膜上のホスファチジルセリンを調べることができます。またアネキシンV染色と細胞膜の完全性のマーカー（RedDot 2、ヨウ化プロピジウム、DAPIなど）を組み合わせることで、アポトーシス細胞とネクローシス細胞を識別することができます。

これらの形態学的特徴とアポトーシスシグナル伝達経路の主要部分を観察、測定することにより、モデルシステムにおける細胞死モードを検証することができます。単一リードでは実験条件によってはアポトーシスとネクローシスの識別などで誤った解析結果に繋がる可能性がありますが、マルチプレックスアッセイ用いることで、単一試料でアポトーシスプロセスをより完全に理解できます。たとえば、TO-PRO-3、アネキシンV、TMRE、およびDAPIを測定することで、 “find-me”シグナルと “eat me” シグナル、ミトコンドリア膜電位、および核の断片化を同時に評価し、アポトーシスが細胞にどのように影響しているかをより複雑に把握できます。従来のアポトーシスマーカー（アネキシンVなど）が非検出で生存可能とみなされていた細胞が、初期アポトーシスマーカー（TO-PRO-3など）によりアポトーシス初期プロセスにあると特定できるようになりました。

このように、アポトーシスのさまざまな段階の複数のマーカーを含むマルチプレックス法は、試料集団全体を、生存可能、初期アポトーシス、後期アポトーシス、アポトーシス小体、非細胞破片という明確な段階に定量的に分割できます。細胞死のさまざまな段階を判定するために、Cayman Chemicals社ではさまざまな細胞ベースのアッセイキットをラインナップしており、目的に応じた適切なアッセイキットをご選択いただくことができます。