変性コラーゲンに特異的なプローブ Collagen Hybridizing Peptide（CHP）

Q-1. 4℃では溶液中のCHPプローブはどれくらい安定していますか？ 再構成後、CHPプローブを分注し、-20℃または-80℃で保存できますか？再構成する前は、-20℃で粉末を保管することを推奨しているのはなぜですか？
A-1. CHPプローブは、溶液で保存中は非常に安定です。以下のデータに示されているとおり、4℃の水溶液中で保管した場合に1年間はほとんど損失なく保存できます。またCHPプローブは、長期保存が必要な場合には小分けして-20℃または-80℃で保存することができます。とは言え、これらのペプチドは複数回の凍結融解を行っても変性や分解することがないため、小分けは必ずしも必要はありません。再構成前の粉体については、未開封で数ヶ月間保存された後に最初の使用となる場合もあるため、製品品質の保証のために-20℃での保存を推奨しています。

Q-2. CHPプローブは、いずれも1ペプチド分子に1標識分子が結合していると考えられますが、製造時にペプチドの長さを検証していますか？もし、CHPプローブがGXYペプチド混合物の場合、1バイアル中のモル数の正確な計算は困難だと思われます。
A-2. ご指摘の点は正しいです。CHPプローブは、1ペプチド分子中にただ1つの標識分子が結合しています。また、CHPプローブは組換え体ではなく、固相上で化学的に合成されています。そのため、製造時にペプチドの長さは正確に制御されています。全製造ロットにおける1バイアル中のCHPプローブは、すべてペプチド鎖長も分子量も厳密に同じです。また、各製品ロットについてHPLCとMALDI-MSを用いて検証を行っています。

Q-3. CHPプローブは、毎回使用前に加熱する必要がありますか？または、再構成時のみに加熱すれば良いですか？未希釈のストック溶液に複数回の加熱－冷却処理を行った場合でも、CHPプローブは安定していますか？
A-3. CHPプローブは、4℃の溶液中でしばらく保存すると、徐々にまた三量体を構築するので、毎回使用前に加熱する必要があります。CHPプローブは化学的にも物理的にも非常に安定で、加熱／冷却を制限なく繰り返すことができます。ただし、ストック溶液の加熱は推奨しません。
推奨操作は、ストック溶液から必要な量（10μl、50μMなど）を分取し、それをPBSで必要な濃度（例えば、50μl、10μMなど）に希釈して小分けします。その後にストック溶液は4℃で再び保管し、希釈・小分けした溶液のみを加熱して実験に用います。従って、この場合ではストック溶液は複数回加熱／冷却されることはなく、希釈溶液のみが一度加熱されます。

Q-4. プロトコル（B)の染色操作のステップ5において、分注に3分以上かかった場合に何か問題ありますか？
A-4. 熱により解離したCHP鎖が再構築されるには数時間かかるので、多少の遅れは問題ありません。しかし、加熱後数時間は置かないで下さい。組織学的研究では、正常組織のコントロールスライドを用いて、病理学的スライドと同じデッドタイムで染色することをお勧めします。この2つのスライドは直接比較できます。しかし、一本鎖のCHP鎖は、加熱後再構築されますので（希釈溶液中では、非常に遅い速度で）、変性コラーゲンへの結合を最大化するためには、冷却とデッドタイムを最小化することをお勧めします。

Q-5. プロトコル（B)の染色操作のステップ6などにおいて、インキュベーションを4℃で行うのはなぜですか？この操作を室温で行うと、何か問題が生じますか？
A-5. 室温または37℃で変性コラーゲンとCHPプローブの結合を行うことはできますが、4℃ではCHPプローブの変性コラーゲンに対する親和性はより強くなります。また、CHPプローブは、凍結組織スライドの免疫染色でもしばしば用いられ、これらの未固定の組織切片の場合、染色の間は4℃に保持する必要があります。これらの理由で、4℃でのインキュベーションを推奨しています。

Q-6. プロトコル（B)の染色操作のステップ6では、最低2時間で、一晩のインキュベーションが推奨されています。2時間と一晩のインキュベーションでは、染色の違いはどうなりますか？
A-6. 参考文献²の図2をご参照下さい。

Q-7. 推奨する固定試薬または固定法は？固定法によって、染色結果は変わりますか？
A-7. 参考文献²に記載されているように、固定の有無は染色結果に影響しません。従って、CHP染色には固定は不要ですが、必要があればCHP染色の前に組織を固定することができます。
蛍光イメージング（F-CHPやR-CHPを使用する場合など）では、組織の固定にはパラホルムアルデヒドやグルタルアルデヒドではなく、ホルムアルデヒドの使用をお勧めします。ホルムアルデヒド固定組織では、特にFITC蛍光チャンネルにおいて自家蛍光が顕著に抑制されるためです。パラホルムアルデヒドやグルタルアルデヒドを用いて組織を固定する必要がある場合は、自家蛍光の問題を避けるため、組織をB-CHPでまず標識し、赤色／近赤外色素（AlexaFluor 647など）または酵素(非蛍光検出の際のHRPなど）で標識されたストレプトアビジンで検出することをお勧めします。

Q-8. スライドをCHPプローブと抗体で共染色するにはどうしたら良いですか？スライドがすでに免疫組織染色されている場合に、CHPプローブで再染色できますか？
A-8. 組織スライドは、CHPプローブと抗体とで容易に共染色することができます。CHP溶液を加熱、室温まで冷却後に一次抗体をCHP溶液に直接加えて希釈できます。そしてCHPと抗体を一緒に4℃で一晩インキュベートして共染色した後、標識二次抗体により検出することができます。操作方法概略はプロトコル（B）と（C)をご参照下さい。また、詳細は参考文献^{2, 4}をご参照下さい。
3Helix社ではすでに免疫組織染色されたスライドにおいて、CHP染色が機能するかについて確認していません。その成否は、正確な免疫組織染色の内容と、CHP結合の視覚化にどのような検出方法を用いるかに依存します。条件が許すなら、最も信頼性の高いCHP画像解析の結果を得るために、未染色のスライドを用いることをお勧めします。

Q-9. 免疫組織染色で抗原賦活化が必要な場合、その処置がCHP染色に影響を及ぼすことがありますか？
A-9. 3Helix社内試験において、熱による抗原賦活化（AR：Antigen retrieval）により組織を処理後にCHP染色性が大幅に増大することを確認しています（非公開）。AR処理により、組織内の総コラーゲン分子が変性してしまうため、AR後にCHP染色を行うと、単に組織内の総コラーゲン含量が示されます。
免疫組織染色でARが必要な場合は、別の隣接するスライドを用いてCHP染色を行うことをお勧めします。これによって、CHP染色は自然に分解または変性されたコラーゲンのみを検出します。

Q-10. 増幅と感度を向上させるには、ビオチン標識CHP（B-CHP）を使用した方が良いですか？
A-10. ほとんどの場合、B-CHP、F-CHP、R-CHPのいずれともよく機能します。より高い感度が必要な場合では、赤色／近赤外領域（AlexaFluor 647など）の蛍光標識ストレプトアビジンによりB-CHPを検出する方法を用いると、複数の蛍光分子がストレプトアビジン分子に結合することから、最良の結果が得られます。HRPもシグナル増強法の一つですが、バックグラウンド染色が発生する場合もあります。

Q-11. 組織学的実験においてネガティブコントロールの使用を推奨しますか？検出シグナルが、変性コラーゲンに結合したCHPプローブに起因していることはどうやって確認することができますか？
A-11. 予熱していないCHPプローブを使用することにより、結合がCHPプローブとコラーゲンとの結合によるものか、非特異的結合によるものかを確認できます。一本鎖のCHPプローブは、4℃の溶液中で三量体を構築する傾向が高く、その状態では変性コラーゲン鎖に結合できません。そのため、CHPプローブと同じ化学的性質を持つ、良いネガティブコントロールとして使用できます。