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変性コラーゲンに特異的なプローブ Collagen Hybridizing Peptide(CHP)

掲載日情報:2019/04/15 現在Webページ番号:68060

Collagen Hybridizing Peptide(CHP)は,コラゲナーゼや結合組織の機械的な損傷などにより変性したコラーゲン鎖に特異的に結合し,三重らせん構造を形成するプローブです。5-FAM標識のF-CHP,Cy3標識のR-CHPと,ビオチン標識のB-CHPがあり,特別な機器や技術を必要とせずに,蛍光検出など様々な適用に対応できます。組織におけるコラーゲンの分解や変性の研究に有用です。
本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

ブタ靭帯

加熱変性したブタ靭帯中のコラーゲンのCHPによる解析
左:F-CHPによる検出
中央:R-CHPによる検出(DAPIで核を対比染色)
右:B-CHPおよびHRP-NeutrAvidinによる検出

特長

  • コラーゲンの三重らせん構造の変性を検出できるプローブです。
  • 変性コラーゲンへの親和性・特異性が高くなっています。
  • コラーゲンの分解や変性の研究に有用です。
  • 抗体と違い,動物種を問わずすべてのタイプのコラーゲンに適用できます。
  • 抗原賦活化の必要はなく,パラフィン包埋切片・凍結切片のいずれでも使用できます。
  • 分子量がIgGの2%程度と小さく組織透過性が高いため,薄切しなくても試料全体の染色に使用できます。
  • 使用には特別な技術は必要なく,測定にも特別な装置は不要です。

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Collagen Hybridizing Peptide(CHP)の検出原理

検出原理

生体内などで見られるコラーゲンのほとんどは,そのタイプに関わらず三重らせん構造を形成しています。このコラーゲンは,コラゲナーゼによる消化,および結合組織の機械的損傷などによって変性することが知られています(上図左)。CHP(別名:CMP,Collagen mimetic peptide)は,この変性コラーゲンに特異的に結合して三重らせんを形成するプローブです(上図右)。コラーゲンマトリックスの構造的完全性を分子レベルで評価でき,また脱細胞化組織作成のプロトコル最適化などに応用することができます。


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使用例

表中の用途をクリックすると,それぞれの使用例およびその解説を別画面でご覧いただけます。

用途 概説
機械的損傷の解析

機械的損傷

分子レベルでコラーゲン組織の機械的損傷とその局在を検出できます。

コラーゲンは,腱や靱帯,骨,軟骨をはじめとするすべての耐荷重性組織の構成に大きく関わっています。これらの組織が機械的損傷を受けると,コラーゲンの変性が引き起こされ病的過程が進みます。この段階では形態学的な変化はマクロスケールでは検出することができません。
CHPは,機械的に引き伸ばされた腱の線維束における,コラーゲンの分子レベルの不全損傷(subfailure damage)を検出することができます。

変性コラーゲンの検出

変性

SDS-PAGEゲル中および加熱処理した組織試料中の,全タイプのコラーゲンを可視化できます。

SDS-PAGEによりコラーゲンを電気泳動すると,SDSの作用や電気泳動中の熱により,ゲル中のコラーゲンが変性します。CHPを用いると,変性コラーゲンと特異的に結合するため,ゲル中の変性コラーゲンを容易に感度良く特異的に検出することが可能です。ウエスタンブロットの必要がないため,時間や手間,試薬を節約できます。
また,CHPは抗コラーゲン抗体や従来のコラーゲン染色試薬の代わりとして使用することができ,組織中の変性したコラーゲンを検出することも可能です。従来のコラーゲン染色試薬であるSirius redは,塩基性アミノ酸を多く含むタンパク質を非特異的に染色することがありました。それに対して,CHPは特異性高く変性コラーゲンを染色することができます。

組織病理学的解析

組織

変性コラーゲンとの結合により多様な疾患による組織損傷やリモデリングを検出できます。

変性コラーゲンの組織病理学的解析は,多くの病理学的な条件下における炎症や組織損傷,および生理学的および発生時における組織再構築の良い指標となります。

脱細胞化組織の評価

脱細胞化

脱細胞化した細胞外マトリックス中のコラーゲンの変性評価を行えます。

脱細胞化された組織から得られた天然の細胞外マトリックス(ECM)は,再生医療に幅広く応用されています。しかしながら脱細胞化の方法によっては,ECMの組成や微細構造が変わってしまい,再生促進機能や生物学的活性にも差が生じてしまいます。
組織学的染色,SEM(走査型電子顕微鏡),TEM(透過型電子顕微鏡)などの従来の方法では,それぞれの方法で脱細胞化されたECMについて,コラーゲンの変性度を定量的に比較評価することは不可能でした。CHP染色は,それらを単純な画像解析により可能にします。

がん細胞浸潤・遊走の解析

がん浸潤

がん転移時のプロテアーゼ依存性ECM分解の可視化を行えます。

がん細胞は,プロテアーゼ依存性/非依存性のいずれかの様式でECMに侵入できますが,一般にはプロテアーゼ依存性による細胞の浸潤を立証するデータを収集することは困難です。
CHPを使用することで,合成ハイドロゲルや遺伝子改変細胞を用いることなく,がん細胞の遊走を視覚化することができます。



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CHPと従来のコラーゲン特性の分析方法との比較


手法 Collagen Hybridizing Peptide
(CHP)
Sirius red /
Masson's trichrome
抗Collagen抗体 抗C1, 2C抗体 in situ
ザイモグラフィー
SHG
(光第二高調波発生イメージング)
TEM
(透過型電子顕微鏡)
変性コラーゲンの検出

可能

不可 不可

可能

可能

可能

可能

変性コラーゲン量の直接的測定

可能

可能

不可 不可 不可
多くのタイプのコラーゲンへの適用

可能

不可 不可 不可
mmサイズの組織への適用

可能

可能

可能

不可
コントロール使用の必要性

不要

必要

不要

不要

特別な測定装置や技術の必要性

不要

必要 必要

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製品の仕様

商品コードをクリックすると価格表をご覧いただけます。

品名 Collagen Hybridizing Peptide,
5-FAM Conjugate
Collagen Hybridizing Peptide,
Cy3 Conjugate
Collagen Hybridizing Peptide,
Biotin Conjugate
製品イメージ F-CHP F-CHP F-CHP
品名略称 F-CHP R-CHP B-CHP
商品コード FLU60 FLU300 RED60 RED300 BIO60 BIO300
化学式 C135H175N31O45 C144H198N33O46S2 C124H181N31O39S
M.W. 2,952.01 g/mol 3,191.44 g/mol 2,762.01 g/mol
包装 60 μg 300 μg 60 μg 300 μg 60 μg 300 μg
使用回数
(組織病理学的解析)
20 tests 100 tests 20 tests 100 tests 20 tests 100 tests
形状 凍結乾燥粉末
純度 95 %(HPLC) 90 %(HPLC) 95 %(HPLC)
可溶性溶媒 水または水系バッファー
検出法 蛍光 (励起 494 nm/蛍光 512 nm) 蛍光 (励起 548 nm/蛍光 563 nm) avidin(またはstreptavidin)標識の蛍光色素,酵素(HRPなど)や金粒子などと組み合わせて検出する

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CHPの医療面での潜在的用途についての動画

画像をクリックすると,3 Helix社の創始者であるDr. Micael Yuによるプレゼンテーションをご覧いただけます。


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FAQ

FAQ (クリックで開閉します)

Q-1. 4℃では溶液中のCHPプローブはどれくらい安定していますか? 再構成後,CHPプローブを分注し,-20℃または-80℃で保存できますか?再構成する前は,-20℃で粉末を保管することを推奨しているのはなぜですか?
A-1. CHPプローブは,溶液で保存中は非常に安定です。以下のデータに示されているとおり,4℃の水溶液中で保管した場合に1年間はほとんど損失なく保存できます。またCHPプローブは,長期保存が必要な場合には小分けして-20℃または-80℃で保存することができます。とは言え,これらのペプチドは複数回の凍結融解を行っても変性や分解することがないため,小分けは必ずしも必要はありません。再構成前の粉体については,未開封で数ヶ月間保存された後に最初の使用となる場合もあるため,製品品質の保証のために-20℃での保存を推奨しています。

Q-2. CHPプローブは,いずれも1ペプチド分子に1標識分子が結合していると考えられますが,製造時にペプチドの長さを検証していますか?もし,CHPプローブがGXYペプチド混合物の場合,1バイアル中のモル数の正確な計算は困難だと思われます。
A-2. ご指摘の点は正しいです。CHPプローブは,1ペプチド分子中にただ1つの標識分子が結合しています。また,CHPプローブは組換え体ではなく,固相上で化学的に合成されています。そのため,製造時にペプチドの長さは正確に制御されています。全製造ロットにおける1バイアル中のCHPプローブは,すべてペプチド鎖長も分子量も厳密に同じです。また,各製品ロットについてHPLCとMALDI-MSを用いて検証を行っています。

Q-3. CHPプローブは,毎回使用前に加熱する必要がありますか?または,再構成時のみに加熱すれば良いですか?未希釈のストック溶液に複数回の加熱-冷却処理を行った場合でも,CHPプローブは安定していますか?
A-3. CHPプローブは,4℃の溶液中でしばらく保存すると,徐々にまた三量体を構築するので,毎回使用前に加熱する必要があります。CHPプローブは化学的にも物理的にも非常に安定で,加熱/冷却を制限なく繰り返すことができます。ただし,ストック溶液の加熱は推奨しません。
推奨操作は,ストック溶液から必要な量(10μl,50μMなど)を分取し,それをPBSで必要な濃度(例えば,50μl,10μMなど)に希釈して小分けします。その後にストック溶液は4℃で再び保管し,希釈・小分けした溶液のみを加熱して実験に用います。従って,この場合ではストック溶液は複数回加熱/冷却されることはなく,希釈溶液のみが一度加熱されます。

Q-4. プロトコル(B)の染色操作のステップ5において,分注に3分以上かかった場合に何か問題ありますか?
A-4. 熱により解離したCHP鎖が再構築されるには数時間かかるので,多少の遅れは問題ありません。しかし,加熱後数時間は置かないで下さい。組織学的研究では,正常組織のコントロールスライドを用いて,病理学的スライドと同じデッドタイムで染色することをお勧めします。この2つのスライドは直接比較できます。しかし,一本鎖のCHP鎖は,加熱後再構築されますので(希釈溶液中では,非常に遅い速度で),変性コラーゲンへの結合を最大化するためには,冷却とデッドタイムを最小化することをお勧めします。

Q-5. プロトコル(B)の染色操作のステップ6などにおいて,インキュベーションを4℃で行うのはなぜですか?この操作を室温で行うと,何か問題が生じますか?
A-5. 室温または37℃で変性コラーゲンとCHPプローブの結合を行うことはできますが,4℃ではCHPプローブの変性コラーゲンに対する親和性はより強くなります。また,CHPプローブは,凍結組織スライドの免疫染色でもしばしば用いられ,これらの未固定の組織切片の場合,染色の間は4℃に保持する必要があります。これらの理由で,4℃でのインキュベーションを推奨しています。

Q-6. プロトコル(B)の染色操作のステップ6では,最低2時間で,一晩のインキュベーションが推奨されています。2時間と一晩のインキュベーションでは,染色の違いはどうなりますか?
A-6. 参考文献2の図2をご参照下さい。

Q-7. 推奨する固定試薬または固定法は?固定法によって,染色結果は変わりますか?
A-7. 参考文献2に記載されているように,固定の有無は染色結果に影響しません。従って,CHP染色には固定は不要ですが,必要があればCHP染色の前に組織を固定することができます。
蛍光イメージング(F-CHPやR-CHPを使用する場合など)では,組織の固定にはパラホルムアルデヒドやグルタルアルデヒドではなく,ホルムアルデヒドの使用をお勧めします。ホルムアルデヒド固定組織では,特にFITC蛍光チャンネルにおいて自家蛍光が顕著に抑制されるためです。パラホルムアルデヒドやグルタルアルデヒドを用いて組織を固定する必要がある場合は,自家蛍光の問題を避けるため,組織をB-CHPでまず標識し,赤色/近赤外色素(AlexaFluor 647など)または酵素(非蛍光検出の際のHRPなど)で標識されたストレプトアビジンで検出することをお勧めします。

Q-8. スライドをCHPプローブと抗体で共染色するにはどうしたら良いですか?スライドがすでに免疫組織染色されている場合に,CHPプローブで再染色できますか?
A-8. 組織スライドは,CHPプローブと抗体とで容易に共染色することができます。CHP溶液を加熱,室温まで冷却後に一次抗体をCHP溶液に直接加えて希釈できます。そしてCHPと抗体を一緒に4℃で一晩インキュベートして共染色した後,標識二次抗体により検出することができます。操作方法概略はプロトコル(B)と(C)をご参照下さい。また,詳細は参考文献2, 4をご参照下さい。
3Helix社ではすでに免疫組織染色されたスライドにおいて,CHP染色が機能するかについて確認していません。その成否は,正確な免疫組織染色の内容と,CHP結合の視覚化にどのような検出方法を用いるかに依存します。条件が許すなら,最も信頼性の高いCHP画像解析の結果を得るために,未染色のスライドを用いることをお勧めします。

Q-9. 免疫組織染色で抗原賦活化が必要な場合,その処置がCHP染色に影響を及ぼすことがありますか?
A-9. 3Helix社内試験において,熱による抗原賦活化(AR:Antigen retrieval)により組織を処理後にCHP染色性が大幅に増大することを確認しています(非公開)。AR処理により,組織内の総コラーゲン分子が変性してしまうため,AR後にCHP染色を行うと,単に組織内の総コラーゲン含量が示されます。
免疫組織染色でARが必要な場合は,別の隣接するスライドを用いてCHP染色を行うことをお勧めします。これによって,CHP染色は自然に分解または変性されたコラーゲンのみを検出します。

Q-10. 増幅と感度を向上させるには,ビオチン標識CHP(B-CHP)を使用した方が良いですか?
A-10. ほとんどの場合,B-CHP,F-CHP,R-CHPのいずれともよく機能します。より高い感度が必要な場合では,赤色/近赤外領域(AlexaFluor 647など)の蛍光標識ストレプトアビジンによりB-CHPを検出する方法を用いると,複数の蛍光分子がストレプトアビジン分子に結合することから,最良の結果が得られます。HRPもシグナル増強法の一つですが,バックグラウンド染色が発生する場合もあります。

Q-11. 組織学的実験においてネガティブコントロールの使用を推奨しますか?検出シグナルが,変性コラーゲンに結合したCHPプローブに起因していることはどうやって確認することができますか?
A-11. 予熱していないCHPプローブを使用することにより,結合がCHPプローブとコラーゲンとの結合によるものか,非特異的結合によるものかを確認できます。一本鎖のCHPプローブは,4℃の溶液中で三量体を構築する傾向が高く,その状態では変性コラーゲン鎖に結合できません。そのため,CHPプローブと同じ化学的性質を持つ,良いネガティブコントロールとして使用できます。


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参考文献

  1. Li, Y., et al., "Targeting and mimicking collagens via triple helical peptide assembly", Curr. Opin. Chem. Biol., 17(6), 968~975, (2013).
  2. Jeongmin, H., et al., "In Situ Imaging of Tissue Remodeling with Collagen Hybridizing Peptides", ACS Nano, 11(10), 9,825~9,835 (2017).
  3. Yang, Li., et al., "Targeting collagen strands by photo-triggered triple-helix hybridization", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 109(37), 14,767~17,772 (2012).
  4. Bennink, LL., et al., "Visualizing collagen proteolysis by peptide hybridization: From 3D cell culture to in vivo imaging", Biomaterials, 183, 67~76 (2018).
  5. Yang, Li., et al., "Direct Detection of Collagenous Proteins by Fluorescently Labeled Collagen Mimetic Peptides", Bioconjugate Chem., 24(1), 9~16 (2013).
  6. Jared, L., et al., "Molecular level detection and localization of mechanical damage in collagen enabled by collagen hybridizing peptides", Nature Communications, 8, 14913 (2017).
  7. Jeongmin, H., et al., "Molecular assessment of collagen denaturation in decellularized tissues using a collagen hybridizing peptide", Acta Biomaterialia, 53, 268~278 (2017).

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価格表

本製品を研究目的でご購入される際には,専用の使用者確約書に必要事項をご記入の上,販売店担当者にお渡し下さい。

[在庫・価格 :2019年10月23日 23時07分現在]

※ 納期として表示している期間は弊社発注日からの「目安」となり、納期を保証する物ではございません。実際には長くかかる場合もございます。ご注意ください。
詳細 商品名
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納期 文献数
Collagen Hybridizing Peptide, 5-FAM Conjugate
- 2
説明文
三重らせん構造が崩れた変性コラーゲンを特異的に検出するプローブ。緑色蛍光5-FAMで標識されており,蛍光で直接観察できる(励起波長: 494 nm / 蛍光波長: 512 nm)。組織スライドを20回染色するのに十分な量を含む。 ※購入時に使用者確約書が必要です。
法規制等
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掲載カタログ

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2週間程度  2
説明文
三重らせん構造が崩れた変性コラーゲンを特異的に検出するプローブ。緑色蛍光5-FAMで標識されており,蛍光で直接観察できる(励起波長: 494 nm / 蛍光波長: 512 nm)。組織スライドを100回染色するのに十分な量を含む。 ※購入時に使用者確約書が必要です。
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ニュース2018年10月15日号 p.13

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2週間程度  0
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3重らせん構造が崩れた変性コラーゲンを特異的に検出するプローブ。赤色蛍光Cy3で標識されており,蛍光で直接観察できる(励起波長: 548 nm / 蛍光波長: 563 nm)。組織スライドを20回染色するのに十分な量を含む。 ※購入時に使用者確約書が必要です。
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三重らせん構造が崩れた変性コラーゲンを特異的に検出するプローブ。ビオチンが修飾されており,蛍光色素やHRP酵素などと組み合わせて使用できる。組織スライドを20回染色するのに十分な量を含む。 ※購入時に使用者確約書が必要です。
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三重らせん構造が崩れた変性コラーゲンを特異的に検出するプローブ。ビオチンが修飾されており,蛍光色素やHRP酵素などと組み合わせて使用できる。組織スライドを100回染色するのに十分な量を含む。 ※購入時に使用者確約書が必要です。
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Collagen Hybridizing Peptide, 5-FAM Conjugate

文献数:2

  • 商品コード:FLU60
  • メーカー:HHH
  • 包装:60μg
  • 価格:¥40,000
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説明文 三重らせん構造が崩れた変性コラーゲンを特異的に検出するプローブ。緑色蛍光5-FAMで標識されており,蛍光で直接観察できる(励起波長: 494 nm / 蛍光波長: 512 nm)。組織スライドを20回染色するのに十分な量を含む。 ※購入時に使用者確約書が必要です。
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文献数:2

  • 商品コード:FLU300
  • メーカー:HHH
  • 包装:300μg
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  • 在庫:無(未発注)
  • 納期:2週間程度 
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文献数:0

  • 商品コード:RED60
  • メーカー:HHH
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  • 価格:¥40,000
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  • 納期:2週間程度 
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説明文 3重らせん構造が崩れた変性コラーゲンを特異的に検出するプローブ。赤色蛍光Cy3で標識されており,蛍光で直接観察できる(励起波長: 548 nm / 蛍光波長: 563 nm)。組織スライドを20回染色するのに十分な量を含む。 ※購入時に使用者確約書が必要です。
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Collagen Hybridizing Peptide, Cy3 Conjugate

文献数:0

  • 商品コード:RED300
  • メーカー:HHH
  • 包装:300μg
  • 価格:¥110,000
  • 在庫:無(未発注)
  • 納期:2週間程度 
  • 法規制等:

説明文 3重らせん構造が崩れた変性コラーゲンを特異的に検出するプローブ。赤色蛍光Cy3で標識されており,蛍光で直接観察できる(励起波長: 548 nm / 蛍光波長: 563 nm)。組織スライドを100回染色するのに十分な量を含む。 ※購入時に使用者確約書が必要です。
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文献数:3

  • 商品コード:BIO60
  • メーカー:HHH
  • 包装:60μg
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  • 納期:2週間程度 
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説明文 三重らせん構造が崩れた変性コラーゲンを特異的に検出するプローブ。ビオチンが修飾されており,蛍光色素やHRP酵素などと組み合わせて使用できる。組織スライドを20回染色するのに十分な量を含む。 ※購入時に使用者確約書が必要です。
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文献数:3

  • 商品コード:BIO300
  • メーカー:HHH
  • 包装:300μg
  • 価格:¥110,000
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説明文 三重らせん構造が崩れた変性コラーゲンを特異的に検出するプローブ。ビオチンが修飾されており,蛍光色素やHRP酵素などと組み合わせて使用できる。組織スライドを100回染色するのに十分な量を含む。 ※購入時に使用者確約書が必要です。
法規制等
保存条件 -20℃ 法規備考
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(テクニカルサポート 試薬担当)

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