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タンパク質―DNA相互作用の解析をcTIP法/改良型CUT&RUN法で行うキット EpiNext cTIP-Sequencing / CUT&RUN Kit

掲載日情報:2021/01/05 現在Webページ番号:68187

少量の哺乳類細胞または単離した核/クロマチンから,タンパク質(ヒストンや転写因子など)と複合体を形成した領域のDNAを迅速に濃縮し,イルミナ社装置を用いた次世代シークエンシング(NGS)やqPCRにより,in vivoにおけるタンパク質―DNA相互作用の同定やマッピングを行うキットです。
NGSライブラリーの調製までを行えるEpiNext cTIP(CUT&Tag In-Place)-Sequencing Kit(#P-2032)と,複合体中のDNAの濃縮・精製までを行うEpiNext CUT&RUN Fast Kit(#P-2028)があります。
RNAのm6A修飾のマッピングを改良型CUT&RUN法で行うキットについてはこちらをご覧下さい。
本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。


EpiNext cTIP Histone使用例
EpiNext cTIP Pol2使用例

EpiNext cTIP(CUT&Tag In-Place)-Sequencing Kit(#P-2032)で調製したライブラリーにおけるフラグメントのサイズ分布
左:HeLa細胞から単離した500 ngのクロマチン試料から,キットに含まれるコントロール抗体(抗H3K9me3抗体)を用いてヒストン/DNA複合体を捕捉し,ライブラリーを調製した。295 bp付近のピークは,モノヌクレオソーム中のDNA(約150 bp)のサイズに対応している。

右:50,000 cellsのJurkat細胞から,抗RNA polymeraseⅡ (PoLⅡ) 抗体を用いてPoLⅡ/DNA複合体を捕捉し,ライブラリーを調製した。280 bp付近のピークは,PoLⅡと結合したDNA(約130 bp)のサイズに対応している。


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ヒストンや転写因子と複合体を形成したDNAの解析について

ヒストンや転写因子と複合体を形成したDNAの解析に必要なことについて

in vivoにおいてヒストンや転写因子とDNAとの複合体を濃縮し,次世代シークエンシングで解析する手法は,ゲノムワイドなタンパク質―DNA相互作用の研究の有力なツールとなります。この手法により,生細胞内において特定のタンパク質が結合するDNA配列の分析が可能になります。その際には,以下のようなことが必要となります。

  • わずかな量の細胞試料から,真に標的タンパク質と結合するDNA領域を確実に特定する。
  • 組織から分離した希少な細胞集団,細胞集団全体からソートした特定の細胞,および胚細胞などの初代培養亜集団細胞などを試料として用いることがある。
  • 濃縮されたDNAに含まれるバックグラウンドが最小限で,タンパク質―DNA結合領域のマッピングにおいて,バイアスが最小限で,また高解像度である必要がある。

ChIP-Seqやその改良法の特長・制約と,Epigentek Group社開発の改良法について

この目的のために,これまで長い間用いられてきた主要な手法は,クロマチン免疫沈降後の次世代シークエンシング(ChIP-Seq)です。しかしながら,ChIPには以下の制約があります。

  • バックグラウンドノイズに対して十分に強いシグナルを生じさせるために,細胞・組織試料を大量に必要とする。
  • 最初の固定化ステップの際に架橋を行う必要があり,ChIP抗体に対するエピトープがマスクされる可能性がある。

ChIP-Seqには,必要細胞数を減らすためや,解像度を上げるために,ChIP-exoやChIPmentationなどの改良法がいくつかあります。
ChIP-exoは,高解像度のマッピングが得られますが,時間を要し,十分量の細胞試料を必要とします。
一方,ChIPmentationは,Transposaseとシークエンシング対応アダプターの使用により,ChIPとライブラリー調製プロセスの統合が可能ですが,従来法のChIPを用いているために2日間の時間を要し,また高解像度のマッピングを行えません。

CUT&RUN法(Cleavage Under Target &Release Using Nuclease)は,少量の生物試料から捕捉した標的タンパク質/DNA複合体を回収し,タンパク質とDNAの相互作用をマッピングするために開発された手法で,マッピングの解像度が大幅に向上しました。しかしながら,DNA切断の際にA / T配列へのバイアスが著しく大きいPA-MNase融合タンパク質を用いるため,MNaseの消化レベルによって標的タンパク質と結合するDNA領域のプロファイルが大きな影響を受けます。また,PA-MNaseはコストを要します。
CUT&Tag法(Cleavage Under Target &Tagmenation)も少量の生物試料から高解像度のマッピングを行えますが,CUT&RUN法と同様にDNA切断の際の配列バイアス・酵素のコストの問題に加え,Tn5 transposaseのクロマチンへのオフターゲットでのアクセスがあり,特異性がより低くなっています。

そこで,Epigentek Group社では,ゲノムワイドにタンパク質―DNA相互作用をマッピングするためのツールとして,改良型CUT&RUN法と,標的部位の切断とアダプター付加をその場(In-Place)で行うcTIP(CUT&Tag In-Place)法の2つのキットを開発しました。これらの手法は,ChIPmentation,ChIP-exo,CUT&RUNのそれぞれ利点を組み合わせた手法で,核酸配列へのバイアスが低い独自の核酸切断酵素ミックスを使用することにより,クロマチンの断片化と,標的タンパク質/DNA複合体の両端のDNA配列の切断/除去を同時に行います。その結果,標的タンパク質と結合したDNAへ影響を及ぼすことなく,タンパク質―DNA相互作用の解析が行えます。


EpiNext cTIPおよびCUTRUN模式図

Epigentek Group社の改良型CUT&RUN法とcTIP法の操作模式図


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特長

  • 信頼性・再現性が高い結果が得られます。
  • 非特異的なバックグラウンドを最小限に抑えて,標的タンパク質/DNA複合体を捕捉できます。
  • 塩基配列へのバイアスが低い独自の核酸切断酵素ミックス*1の使用により,クロマチンの断片化と,標的タンパク質/DNA複合体の両端のDNA配列の切断/除去を同時に行い,標的タンパク質と結合したDNAへ影響を及ぼしません。
  • 超音波処理なしでの確実な断片化,非結合DNAの切断,イムノキャプチャー,ビーズ上でのライゲーションのすべてのプロセスを同一のチューブ内で行うことにより,試料損失を最小限に抑え,標的タンパク質を最大限に保護します。
  • 濃縮したDNAを,効率的かつ迅速に回収でき,高解像度のマッピングや同定が確実に行えます。
  • キットには検証用に,ポジティブコントロール抗体(Anti-H3K9me3),ネガティブコントロール抗体(non-immune IgG),コントロールクロマチンが含まれています。
  • 濃縮したDNAは,バーコード配列なし(シングルプレックス),バーコード配列付き(マルチプレックス)いずれのライブラリーの調製にも適しています。
  • <1,000万回の読み取り深度でシークエンンスデータ分析が可能です。
  • EpiNext cTIP(CUT&Tag In-Place)-Sequencing Kit(#P-2032)は,クロマチンの断片化・非結合DNAの切断の後,DNA精製の前にその場(In-Place)でアダプター付加を行うため,<70 bpの極めて短い断片を含めた転写因子結合DNA断片からライブラリーを調製できます。

*1 オリジナルの手法では核酸切断のステップにおいて,CUT&RUN法はPA-MNaseを,CUT&Tag法ではTn5 transposaseを用いています。本キットでは,核酸配列へのバイアスが低い独自の核酸切断酵素ミックスを使用します。
標的タンパク質/DNA複合体に対する抗体が別途必要です。


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製品仕様

商品コードをクリックすると価格表をご覧になれます。

キット名EpiNext cTIP(CUT&Tag In-Place)-Sequencing KitEpiNext CUT&RUN Fast Kit
商品コードP-2032 P-2028
手 法cTIP(CUT&Tag In-Place)-Sequencing法改良型CUT&RUN法
キットでできることNGSライブラリーの調製までタンパク質/DNA複合体に結合したDNAの濃縮・精製まで
(ライブラリー調製用試薬またはqPCR試薬が別途必要)
試 料哺乳類細胞または単離した核/クロマチン
細胞試料の由来培養細胞,初代細胞,血液・体液などから単離した細胞,全細胞集団からソートした特定の細胞,胚細胞,新鮮/凍結組織*2 など
標的タンパク質の種類ヒストンや転写因子
試料量・細胞:2×103~2×105 cells(推奨:1×105 cells,最小:500 cellsでの使用実績あり)
・クロマチン:0.1~5μg(推奨:2μg,最小:50 ng*3での使用実績あり)
濃縮するDNAのサイズ<70 bp>20 bp
NGSの読み取り深度<1,000万回

*2 新鮮/凍結組織試料の場合,ChromaFlash Chromatin Extraction Kitを用いてクロマチン単離することをお勧めします。
*3 EpiNext cTIP(CUT&Tag In-Place)-Sequencing Kitの場合。


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操作方法概略

EpiNext cTIP(CUT&Tag In-Place)-Sequencing Kit

EpiNext cTIP Kit操作方法

■ 操作時間の目安

ステップおおよその時間
細胞の溶解と核・クロマチンの単離20分
抗体による捕捉とDNA切断100分
ビーズ上で,DNAの平滑末端化と,アダプターのライゲーション60分
DNAの回収・精製40分
ライブラリーの増幅・精製50分
合計5時間以内

記載の時間は参考値です。

EpiNext CUT&RUN Fast Kit

EpiNext CUT&RUN Kit操作方法

■ 操作時間の目安

ステップおおよその時間
細胞の溶解と核・クロマチンの単離20分
抗体による捕捉とDNA切断100分
DNAの回収・精製40分
合計3時間以内

記載の時間は参考値です。


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使用例

EpiNext CUT&RUN Fast DNA濃縮例

EpiNext CUT&RUN Fast Kit(#P-2028)によるタンパク質/DNA複合体の捕捉
100,000 cellsのJurkat細胞から,それぞれ抗H3K9me3抗体,抗RNA polymeraseⅡ (PoLⅡ) 抗体,ネガティブコントロール抗体(non-immune IgG)を用いてタンパク質/DNA複合体を捕捉した。その後,DNAを精製し,蛍光測定により濃縮の度合いを求めた。

EpiNext CUT&RUN Fast Histone

EpiNext CUT&RUN Fast Kit(#P-2028)で調製したライブラリーにおけるフラグメントのサイズ分布
HeLa細胞から単離した1μgのクロマチン試料から,キットに含まれるコントロール抗体(抗H3K9me3抗体)を用いてヒストン/DNA複合体を捕捉し,ライブラリーを調製した。290 bp付近のピークは,モノヌクレオソーム中のDNA(約150 bp)のサイズに対応している。


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キット内容

標的タンパク質/DNA複合体に対する抗体や,96 well PCRプレートフォーマットの磁気スタンドなどが別途必要です。


キット名EpiNext cTIP
(CUT&Tag In-Place)
-Sequencing Kit
EpiNext CUT&RUN
Fast Kit
Wash buffer
Lysis buffer
Capture buffer
Nuclear digestion enhancer
Protease inhibitor cocktail
Cleavage enzyme mix
Control antibody (Anti-H3K9me3)
Non-Immune IgG
Control chromatin
Protein digestion buffer
Proteinase K
Affinity beads
Elution buffer
DNA purification solution
DNA binding beads
End repair buffer
End repair enzyme mix
dA tailing buffer
dA tailing enzyme
Ligation buffer
T4 DNA ligase
Adaptors
MQ binding beads
HiFi PCR master mix
Primer U / I

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価格

EpiNext cTIP(CUT&Tag In-Place)-Sequencing Kit

[在庫・価格 :2021年06月24日 11時51分現在]

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EpiNext cTIP(CUT&Tag In-Place)-Sequencing Kit
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EpiNext CUT&RUN Fast Kit

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EpiNext CUT&RUN Fast Kit
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EpiNext CUT&RUN Fast Kit

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Chromatin Extraction Kit, ChromaFlash (100extractions)
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哺乳動物の細胞・組織試料からクロマチンおよびDNA-タンパク質複合体を迅速かつ簡便に抽出するキット。得られたクロマチンは,ChIP,in vitroでのDNA-タンパク質相互作用のアッセイ,核内酵素を用いたアッセイなどに使用可能。
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保存条件 室温,4℃ 法規備考
掲載カタログ ニュース2020年5月1日号 p.19
ニュース2019年4月1日号 p.16

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EpiMag HT (96-Well) Magnetic Separator
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96ウェルプレートをセットして使用できるマグネチックセパレーター。磁性ビーズによる核酸やタンパク質の単離,精製などをハイスループットに行うことが可能。
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EpiMag HT (96-Well) Magnetic Separator

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High-Sensitivity DNA Library Preparation Kit, Illumina, EpiNext(12reactions)
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General DNA Quantification Kit, FitAmp (48samples)
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アッセイ法:Quantification,測定範囲:1-1,000 ng/ml,アッセイ数:48 samples,検出方法:蛍光,測定波長:480~500/520~550 nm
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EpiQuik Quantitative PCR Fast Kit (100reactions)
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お問い合わせ先

(テクニカルサポート 試薬担当)

reagent@funakoshi.co.jp

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表示価格に、消費税等は含まれていません。一部価格が予告なく変更される場合がありますので、あらかじめご了承下さい。