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生細胞を用いた脂肪滴の長時間イメージングに有用です! LipiDye®

掲載日情報:2024/02/22 現在Webページ番号:65701

フナコシ /
フナコシ株式会社
[メーカー略称:FNA]

長時間の生細胞イメージングに優れた高感度な脂肪滴染色試薬です。高い脂肪滴特異性に加え、低毒性かつ極めて高い光安定性を誇り、数日単位の長時間観察や脂肪滴融合・分解プロセスの生細胞イメージング、超高解像度顕微鏡での超微小脂肪滴の可視化に有用です。

本製品は名古屋大学 トランスフォーマティブ生命分子研究所 山口茂弘教授、多喜正泰特任准教授の研究成果をもとに、フナコシ株式会社が製品化し、販売しています。
LipiDye®は、LipiDye®(#FDV-0010)の改良版試薬です。
本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。


LipiDye<sup>®</sup>Ⅱによる脂肪細胞(Adipocytes)の染色例

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LipiDye®Ⅱによる脂肪細胞(Adipocytes)の染色例

LipiDye<sup>®</sup>Ⅱによる非脂肪細胞(Non-adipocyte)の染色例

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LipiDye®Ⅱによる非脂肪細胞(Non-adipocytes)の染色例

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脂肪滴(Lipid droplet)とLipiDye®Ⅱについて

脂肪滴(Lipid droplet)とは

脂肪滴(Lipid droplet)とは脂肪細胞(Adipocyte)で見られる巨大な中性脂質の塊で、トリグリセリド(Triglyceride)やステロールエステル(Sterol Ester)を主成分とする一重膜の構造体です(下図)。脂肪滴は細胞内の中性脂質を貯蔵する器官として働くと考えられており、肥満や疾患との関連が多く報告されています。近年、脂肪細胞に関わらず、肝細胞や平滑筋細胞、グリア細胞などさまざまな細胞で発見されており、従来考えられていた中性脂質の貯蔵器官としての役割だけでなく、代謝制御や遺伝子発現調節などさまざまな機能が明らかになってきました。さまざまな細胞において脂肪滴の観察が行われていますが、非脂肪細胞の脂肪滴は1 μm以下で脂肪細胞の10~100 μmに比べて非常に小さいことが知られています(下図)。そのため、生細胞での非脂肪細胞の微小な脂肪滴をイメージングで検出する試薬が期待されていましたが、Nile Redなどの既存試薬は脂肪滴以外の染色が見られる(S / N比が低い)、生細胞イメージングに不向きなどの問題があり、微小脂肪滴の観察は電子顕微鏡観察に限定されていました。

LipiDye®Ⅱについて

当社製品LipiDye®(#FDV-0010)は高いS / N比を示す脂肪滴染色試薬で、1 μm以下の微小な脂肪滴の検出にも優れていますが、光安定性の観点から長時間の生細胞イメージングには不十分でした。LipiDye®Ⅱはこれらの課題を克服すべく名古屋大学 トランスフォーマティブ生命分子研究所(ITbM)の山口教授、多喜特任准教授が2020年に開発した新規脂肪滴検出試薬(原著論文名 LAQ1)で、極めて高い光安定性を示し、低毒性で長時間の安定した生細胞イメージングが可能です。


脂肪滴の模式図

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脂肪滴の模式図

脂肪細胞(adipocyte)に見られる大型な脂肪滴

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脂肪細胞(Adipocyte)に見られる
大型な脂肪滴

脂肪細胞の脂肪滴

脂肪細胞の脂肪滴

非脂肪細胞の脂肪滴

非脂肪細胞の脂肪滴

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特長

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蛍光波長(励起・検出波長)について

  • 吸収極大 410~420 nmですが、450~500 nm領域の光源でも励起可能です。詳しくは励起・蛍光スペクトルデータをご参照下さい。
  • 800 nmレーザーによる二光子励起が可能です。詳しくは二光子顕微鏡によるミクログリアの観察をご参照下さい。
  • 多重染色も可能ですが、波長選択について注意が必要です。励起光が500 nm以上の色素をご使用下さい。450 nm以下の領域で励起する一般的な青色蛍光色素を用いた場合、本試薬も同時励起される可能性があります。

光源例

  • レーザー光の場合:405 nm, 445 nm, 458 nm, 473 nm, 488 nm
  • 光源+フィルターの場合:一般的なFITCやGFPフィルターが利用可能。
  • STED超高解像度顕微鏡の場合:推奨励起光:473 nmレーザー、STED光:660 nmレーザー

488 nmレーザーでも励起可能ですが、405~473 nmレーザーに比べ得られる蛍光強度が弱いため、目的の実験ごとに観察条件の検証を推奨しています。

LipiDye®および既存試薬に対する優位性


試薬名 励起光の波長 染色 多重染色 S/N比 光安定性 タイムラプス
イメージング
固定細胞 生細胞
LipiDye® 緑色蛍光 400~500 nm
(☞ 波長選択注意
高い 極めて高い 非常に長い時間可
LipiDye® 緑色蛍光 400~470 nm 高い 高い 短時間なら可
蛍光色素B 緑色蛍光 ~480 nm 低い
Nile Red 赤色蛍光 ~510 nm 不向き 低い 低い 不向き
脂肪滴染色試薬A 赤色緑色蛍光 不可 高い 不明 不可
Oil Red O 赤色色素 不可 低い 不可

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参考データ

励起/蛍光スペクトル

LipiDye<sup>®</sup>Ⅱの励起スペクトル

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LipiDye®Ⅱの励起スペクトル
LipiDye®Ⅱは溶媒環境応答性蛍光色素(Solvatochromic dye)で、周囲の分子極性に応じて蛍光波長が変化する。吸収スペクトルは溶媒にほとんど影響を受けず、380~500 nmに吸収が見られる。

  • 推奨励起光:405 nm, 445 nm, 458 nm, 473 nmレーザー
  • 使用可能励起光:488 nmレーザー(蛍光強度が弱いため、実験ごとに使用濃度などの検証を推奨。)

LipiDye<sup>®</sup>Ⅱの蛍光スペクトルの溶媒極性による影響

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LipiDye®Ⅱの蛍光スペクトルの溶媒極性による影響
蛍光スペクトルは溶媒極性に大きく依存し、TolueneやDichloromethaneなどの疎水性環境下では強い色蛍光を示すが、Acetonitrile、DMSOや水溶液といった高極性環境では極性が大きくなるほど蛍光極大は長波長側にシフトし、蛍光強度は著しく抑制される。この特性により、脂肪滴の疎水性環境特異的な緑色蛍光が観察できる。

脂肪滴での蛍光の評価

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LipiDye®Ⅱで細胞を染色し、脂肪滴部分を顕微鏡でスペクトルスキャンして脂肪滴での蛍光を評価すると、500 nm付近を極大とする蛍光スペクトルが観察される。

図A~Cいずれも灰色網掛け領域が推奨の励起・蛍光波長。

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光安定性

LipiDye<sup>®</sup>Ⅱの光安定性

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4%パラホルムアルデヒドで固定処理した3T3-L1脂肪細胞を、LipiDye®Ⅱ、従来製品LipiDye®および従来の蛍光色素Bで染色後、共焦点レーザー顕微鏡によるZ-stackイメージング(励起:473 nm/蛍光:490~540 nm)を繰り返し行い、蛍光強度の推移を観察した。Z-stackイメージングでは1回の撮影当たり2 μmずつ10枚取得した。従来色素Bが約5回のZ-stackイメージングで著しく傾向が減衰したのに対して、従来製品LipiDye®は耐光性を示すものの、徐々に減衰が見られ、50回のZ-stackイメージング後は約60%程度まで蛍光減衰が認められた。
一方で本試薬LipiDye®Ⅱは50回(計500回の光照射)でもほとんど蛍光強度の変化が認められなかった。LipiDye®Ⅱが極めて高い光安定性を示し、長時間にわたるタイムラプスイメージング(Z-stackイメージング含む)に有用であることが示された。

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細胞毒性

LipiDye<sup>®</sup>Ⅱの細胞毒性

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3T3-L1脂肪細胞を各濃度のLipiDye®Ⅱで処理し、24時間後の細胞生存性をMTTアッセイで評価した。本試薬の推奨使用濃度は0.1~1 μMだが、少なくとも5 μMまで細胞毒性は観察されなかった。10 μM以上で細胞毒性が観察された。

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生細胞・固定細胞染色

LipiDye<sup>®</sup>Ⅱの生細胞・固定細胞染色性

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生細胞状態の3T3-L1脂肪細胞をLipiDye®Ⅱで染色後、生細胞で蛍光観察を行った(左)。その後、4%パラホルムアルデヒドで細胞を固定し洗浄した後、固定状態で再度蛍光観察を行った(右)。固定処理前後で蛍光シグナルの変化はほとんど見られなかった。本試薬は生細胞で染色・観察後、固定して免疫染色にも利用可能であることが示された。

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アプリケーションデータ

さまざまな細胞での染色

3T3-L1、HepG2、COS-7、HeLa細胞それぞれをLipiDye®Ⅱ(1 μM)で染色し、共焦点レーザー顕微鏡で緑色蛍光(励起473 nm/蛍光490~540 nm)を観察した(スケールバー:20 μm)。HepG2細胞は脂肪滴形成のために脂肪酸で1日間処理した。HeLa細胞では1 μm以下の小さな脂肪滴が明瞭に観察できた(HeLa細胞拡大図(右側)参照、スケールバー:5 μm)。

3T3-L1 HepG2 Cos7 HeLa
3T3-L1細胞蛍光画像 HepG2細胞蛍光画像 COS7細胞蛍光画像 HeLa細胞蛍光画像 HeLa細胞蛍光画像(拡大)
3T3-L1細胞明視野画像 HepG2細胞明視野画像 COS7細胞明視野画像 HeLa細胞明視野画像

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小胞体(ER)マーカーとのマルチカラーイメージング

小胞体(ER)局在性赤色蛍光タンパク質(ER-mKO1)を発現させたCOS-7細胞をLipiDye®Ⅱ(1 μM)で染色し、共焦点レーザー顕微鏡で蛍光観察(LipiDye®Ⅱ:励起473 nm/蛍光490~540 nm、ER-mKO1:励起559 nm/蛍光570~620 nm)した。COS-7細胞の内在性の小さな脂肪滴(<1 μm)が観察され、その多くがERの網目構造の内側に局在することが観察された(右側拡大図参照、スケールバー:1 μm)。この結果は、脂肪滴がERから生合成されることと一致する。

LipiDye Ⅱ ER Merge
LipiDye Ⅱ染色蛍光画像 赤色蛍光タンパク質(ER-mKO1)発現ER蛍光画像 Merge
LipiDye Ⅱ染色蛍光画像 赤色蛍光タンパク質(ER-mKO1)発現ER蛍光画像 Merge Merge

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脂肪細胞の分化過程の長時間観察

脂肪前駆細胞3T3-L1を脂肪細胞に分化誘導する際の脂肪滴成熟の様子を、8日間にわたりLipiDye®Ⅱ(1 μM)を用いて共焦点レーザー顕微鏡で生細胞観察した(励起473 nm/蛍光490~540 nm)。3T3-L1細胞を最初の2日間LipiDye®Ⅱ(1 μM)を含む分化培地で培養した後、2日おきにLipiDye®Ⅱ(1 μM)を含む維持培地に交換し、合計8日間蛍光観察した。LipiDye®Ⅱで長期間処理しても、細胞毒性や脂肪細胞分化に影響を及ぼすことなく脂肪滴成熟過程を観察することができた。

脂肪細胞の分化過程の長時間観察-0 day 脂肪細胞の分化過程の長時間観察-2 days 脂肪細胞の分化過程の長時間観察-4 days 脂肪細胞の分化過程の長時間観察-6 days 脂肪細胞の分化過程の長時間観察-8 days
脂肪細胞の分化過程の長時間観察
1 μM LipiDye®
in differentiation medium
1 μM LipiDye®
in maintain medium
1 μM LipiDye®
in maintain medium
1 μM LipiDye®
in maintain medium

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生細胞イメージングによる新生脂肪滴の動的挙動解析

脂肪前駆細胞3T3-L1を脂肪細胞に分化誘導する際に新生した脂肪滴の動的挙動を、長時間タイムラプスイメージング(Z-stackイメージング)で約24時間(共焦点レーザー顕微鏡:励起473 nm/蛍光490~540 nm、10分毎の撮影、Z-stack 20枚/回)観察した。あらかじめLipiDye®Ⅱで染色した脂肪前駆細胞に分化培地(LipiDye®Ⅱを含む)を添加した直後からタイムラプスイメージングを開始した。分化誘導後10時間程度経過した頃から小さな脂肪滴が見えはじめ(650 min、)、個々の脂肪滴は互いに相互作用しながら大きくなっていく様子が観察された(950~1,450 min、)。

生細胞イメージングによる新生脂肪滴の動的挙動解析(450 min) 生細胞イメージングによる新生脂肪滴の動的挙動解析(650 min) 生細胞イメージングによる新生脂肪滴の動的挙動解析(950 min) 生細胞イメージングによる新生脂肪滴の動的挙動解析(1,050 min)
生細胞イメージングによる新生脂肪滴の動的挙動解析(1,150 min) 生細胞イメージングによる新生脂肪滴の動的挙動解析(1,250 min) 生細胞イメージングによる新生脂肪滴の動的挙動解析(1,350 min) 生細胞イメージングによる新生脂肪滴の動的挙動解析(1,450 min)

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脂肪滴分解・新生プロセスの経時的観察

分化誘導した3T3-L1細胞にアデニル酸シクラーゼ活性化物質であるForskolin(10 μM)およびホスホジエステラーゼ阻害物質IBMX(100 nM)を添加し、トリアシルグリセロール分解に伴う脂肪滴の縮小過程をLipiDye®Ⅱを用いたタイムラプスイメージング(Z-stackイメージング)で観察した(共焦点レーザー顕微鏡:励起473 nm/蛍光490~540 nm、800分間、4分毎の撮影、Z-stack 15枚/回)。もともと存在した大きな脂肪滴(参照)は時間依存的に小さくなっていることが確認できる。また、時間依存的に小さな脂肪滴()が多数生成していることが分かる。
LipiDye®Ⅱは極めて高い光安定性を有することにより退色の心配がなく、高いS / N比を示すことにより微小の新生脂肪滴も観察できるため、脂肪滴の増減を定量的に観察可能であることが示された。

Forskolin + IBMX
0 min 160 min 320 min 480 min
脂肪滴分解・新生プロセスの経時的観察-0 min 脂肪滴分解・新生プロセスの経時的観察-160 min 脂肪滴分解・新生プロセスの経時的観察-320 min 脂肪滴分解・新生プロセスの経時的観察-480 min

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蛍光プレートリーダーによる細胞内脂肪滴量の相対評価

3種類の細胞株(ヒト腎がん細胞株 786-O、マウス神経芽細胞種 Neuro2a、チャイニーズハムスター卵巣細胞株 CHO)を96 wellプレートに1×104 cell/wellで播種し、10% FBS/DMEM培地で24時間培養後、脂肪滴の産生を促進するため10~200 μMオレイン酸を含む10% FBS/DMEMに交換し、さらに24時間培養した。その後、細胞をPBSで洗浄し、LipiDye®Ⅱ(5 μM)を含む2% FBS/DMEMで2時間染色した。PBSで2回細胞を洗浄し、蛍光プレートリーダーで蛍光強度(Ex 420±5 nm/Em 503±10 nm)を測定した。いずれの細胞においてもオレイン酸の添加濃度依存的に蛍光強度の増加が見られた。

蛍光プレートリーダーによる細胞内脂肪滴量の相対評価

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STED超高解像度顕微鏡による微小脂肪滴の可視化

HeLa細胞をLipiDye®Ⅱ(1 μM)で染色し、共焦点レーザー顕微鏡(励起473 nm/蛍光490~540 nm)およびSTED超高解像度顕微鏡(励起473 nm+STED 660 nm/蛍光500~640 nm)で微小脂肪滴の観察を試みた。STED観察像はDeconvolution処理を行ったデータを示している。共焦点レーザー顕微鏡では不明瞭な微小脂肪滴が観察されたのに対し、STED顕微鏡では明瞭に確認され、半値幅(FWHM)は約120 nmであった。
STED顕微鏡の観察条件および解析方法は原著論文をご参照下さい。

STED超高解像度顕微鏡による微小脂肪滴の可視化(共焦点レーザー顕微鏡観察) STED超高解像度顕微鏡による微小脂肪滴の可視化(共焦点レーザー顕微鏡観察)
STED超高解像度顕微鏡による微小脂肪滴の可視化(STED超高解像度顕微鏡観察) STED超高解像度顕微鏡による微小脂肪滴の可視化(STED超高解像度顕微鏡観察)

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二光子顕微鏡によるミクログリアの観察

ラット初代培養ミクログリアにLipiDye®Ⅱ(1 μM)を添加し終夜染色後、4% PFAで固定し二光子顕微鏡(励起 800 nm/蛍光 510~560 nm)で観察した。LipiDye®Ⅱは二光子励起法でも励起が可能で、初代培養ミクログリアにおける大小さまざまなサイズの脂肪滴を検出できた。

二光子顕微鏡によるミクログリアの観察" 二光子顕微鏡によるミクログリアの観察(明視野-拡大図)
二光子顕微鏡によるミクログリアの観察(蛍光-拡大図)

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(データ提供:Dr. Hyun Beom Choiおよび Dr. Brian MacVicar, The University of British Columbia)

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LipiDye®Ⅱご使用ユーザー様の声

Users_Voice

『従来試薬に比べ退色しづらく、透明化した脂肪組織の観察および3D画像構築にも有用でした。』

大学ご所属のユーザー様



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原著論文

  • Taki, M., et al., "Fused Thiophene-S,S-dioxide-Based Super-Photostable Fluorescent Marker for Lipid Droplets.", ACS Mater. Lett., 3(1), 42~49 (2021). ( reference

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価格

[在庫・価格 :2024年10月08日 20時55分現在]

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納期 文献数
LipiDye II <Lipid Droplet Live Imaging>
1週間程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 0
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キャンペーン期間 2024/10/01 ~ 2024/11/29
説明文
長時間の生細胞イメージングに優れた高感度な脂肪滴(Lipid droplet)の染色試薬。高い脂肪滴特異性に加え,低毒性かつ極めて高い光安定性を誇り,数日単位の長時間観察や脂肪滴融合・分解プロセスの生細胞イメージング,超高解像度顕微鏡での超微小脂肪滴の可視化に有用。(励起400~500 nm/蛍光490~550 nm)。
法規制等
保存条件 室温 法規備考
掲載カタログ ニュース2022年10月1日号 p.5
ニュース2023年8月合併号 p.27

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NAFLD / NASH研究用試薬
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LipiDye II <Lipid Droplet Live Imaging>

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[FNA]funakoshiブランド製品40%OFFキャンペーン 第三弾 [~2024/11/29]
説明文 長時間の生細胞イメージングに優れた高感度な脂肪滴(Lipid droplet)の染色試薬。高い脂肪滴特異性に加え,低毒性かつ極めて高い光安定性を誇り,数日単位の長時間観察や脂肪滴融合・分解プロセスの生細胞イメージング,超高解像度顕微鏡での超微小脂肪滴の可視化に有用。(励起400~500 nm/蛍光490~550 nm)。
法規制等
保存条件 室温 法規備考
掲載カタログ ニュース2022年10月1日号 p.5
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お問い合わせ先

(テクニカルサポート 試薬担当)

reagent@funakoshi.co.jp

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