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高感度な脂肪滴長時間イメージング試薬 LipiDye®

掲載日情報:2020/12/01 現在Webページ番号:65701

フナコシ /
フナコシ株式会社

長時間の生細胞イメージングに優れた高感度な脂肪滴染色試薬です。高い脂肪滴特異性に加え,低毒性かつ極めて高い光安定性を誇り,数日単位の長時間観察や脂肪滴融合・分解プロセスの生細胞イメージング,超高解像度顕微鏡での超微小脂肪滴の可視化に有用です。

ご案内 :LipiDye®Ⅱは,LipiDye®(#FDV-0010)の改良版試薬となります。従来製品LipiDye®の製品情報はこちらをご覧下さい。


本製品は名古屋大学 トランスフォーマティブ生命分子研究所 山口茂弘教授,多喜正泰特任准教授の研究成果をもとに,フナコシ株式会社が製品化し,販売しています。
本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。


LipiDye2による脂肪細胞,非脂肪細胞の染色例

LipiDye®Ⅱによる脂肪細胞および非脂肪細胞の染色例


脂肪滴(Lipid droplet)とLipiDye®について

脂肪滴(Lipid droplet)とは脂肪細胞(Adipocyte)で見られる巨大な中性脂質の塊で,トリグリセリド(Triglyceride)やステロールエステル(Sterol Ester)を主成分とする一重膜の構造体です(図1)。脂肪滴は細胞内の中性脂質を貯蔵する器官として働くと考えられており,肥満や疾患との関連が多く報告されています。近年,脂肪細胞に関わらず,肝細胞や平滑筋細胞,グリア細胞など様々な細胞で発見されており,従来考えられていた中性脂質の貯蔵器官としての役割だけでなく,代謝制御や遺伝子発現調節など様々な機能が明らかになってきました。様々な細胞において脂肪滴の観察が行われていますが,非脂肪細胞の脂肪滴は1μm以下で脂肪細胞の10~100μmに比べて非常に小さいことが知られています(図2)。そのため,生細胞での非脂肪細胞の微小な脂肪滴をイメージングで検出する試薬が期待されていましたが,Nile Redなどの既存試薬は脂肪滴以外の染色が見られる(S / N比は低い),生細胞イメージングに不向きなどの問題があり,微小脂肪滴の観察は電子顕微鏡観察に限定されていました。

当社製品LipiDye®は高いS / N比を示す脂肪滴染色試薬で,1μm以下の小さな脂肪滴の検出に優れていますが,光安定性の観点から長時間の生細胞イメージングには不十分でした。LipiDye®Ⅱはこれらの課題を克服すべく名古屋大学 トランスフォーマティブ生命分子研究所(ITbM)の山口教授,多喜特任准教授が2020年に開発した新規脂肪滴検出試薬(原著論文名 LAQ1)で,極めて高い光安定性を示し,低毒性で長時間の安定した生細胞イメージングが可能です。


脂肪滴の模式図および脂肪細胞に見られる大型な脂肪滴

図1:脂肪滴の模式図および脂肪細胞(adipocyte)に見られる大型な脂肪滴



それぞれの細胞種における脂肪滴のイメージ図

図2:それぞれの細胞種における脂肪滴のイメージ図




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特長

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蛍光波長(励起・検出波長)について

励起/蛍光波長:400~500 nm/490~600 nm
吸収極大 410~420 nmですが,450~500 nm領域の光源でも励起可能です。詳しくは励起・蛍光スペクトルデータをご参照下さい。
800 nmレーザーによる二光子励起が可能です。詳しくは二光子顕微鏡によるミクログリアの観察をご参照下さい。
多重染色も可能ですが,波長選択について注意が必要です。励起光が500 nm以上の色素をご使用下さい。450 nm以下の領域で励起する一般的な青色蛍光色素を用いた場合,本試薬も同時励起される可能性があります。

■ 光源例

レーザー光の場合 405 nm, 445 nm, 458 nm, 473 nm, 488 nmなど
488 nmレーザーでも励起可能ですが,405~473 nmレーザーに比べ得られる蛍光強度が弱いため,目的の実験ごとに観察条件の検証を推奨しています
光源+フィルターの場合一般的なFITCやGFPフィルターが利用できます
STED超高解像度顕微鏡の場合推奨励起光:473 nmレーザー,STED光:660 nmレーザー

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LipiDye®および既存試薬に対する優位性

試薬名励起光
の波長
生細胞
の染色
固定細胞
の染色
光安定性タイムラプス
イメージング
多重染色S / N比
LipiDye®緑色蛍光400~500 nm極めて高い非常に長い時間可
(波長選択注意)
高い
LipiDye®緑色蛍光400~470 nm高い短時間なら可
(波長選択注意)
高い
Nile Red赤色蛍光~510 nm低い不向き不向き低い
蛍光色素B緑色蛍光~480 nm低い
脂肪滴
染色試薬A
赤色緑色蛍光不可不明不可高い
Oil Red O赤色色素不可不可低い

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原著論文


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参考データ

励起/蛍光スペクトル

LipiDye®Ⅱは溶媒環境応答性蛍光色素(Solvatochromic dye)で,周囲の分子極性に応じて蛍光波長が変化します。吸収スペクトルは溶媒にほとんど影響を受けず,380~500 nmに吸収が見られます(図A)。

  ・推奨励起光:405 nm, 445 nm, 458 nm, 473 nmレーザー
  ・使用可能励起光:488 nmレーザー(蛍光強度が弱いため,実験ごとに使用濃度等の検証を推奨しています。)

一方,蛍光スペクトルは溶媒極性に大きく依存し,TolueneやDichloromethaneなどの疎水性環境下では強い青~緑色蛍光を示しますが,Acetonitrile,DMSOや水溶液といった高極性環境では極性が大きくなるほど蛍光極大は長波長側にシフトし蛍光強度は著しく抑制されます(図B)。この特性により,脂肪滴の疎水性環境特異的な緑色蛍光が観察できます。
LipiDye®Ⅱで細胞を染色し,脂肪滴部分を顕微鏡でスペクトルスキャンして脂肪滴での蛍光を評価すると,500 nm付近を極大とする蛍光スペクトルが観察されています(図C)。
図A~Cいずれも灰色網掛け領域が推奨の励起・蛍光波長。

LipiDye2の吸収スペクトル
LipiDye2の蛍光スペクトル(水中)
LipiDye2の蛍光スペクトル(脂肪滴中)


光安定性

4%パラホルムアルデヒドで固定処理した3T3-L1脂肪細胞を,新製品LipiDye®Ⅱ,従来製品LipiDye®および従来の蛍光色素Bで染色後,共焦点レーザー顕微鏡によるZ-stackイメージング(励起:473 nm/蛍光:490~540 nm)を繰り返し行い,蛍光強度の推移を観察した。Z-stackイメージングでは1回の撮影当たり2μmずつ10枚取得した。従来色素Bが約5回のZ-stackイメージングで著しく傾向が減衰したのに対して,従来製品LipiDye®は耐光性を示すものの,徐々に減衰が見られ50回のZ-stackイメージング後は約60%程度まで蛍光減衰が認められた。
一方で本試薬LipiDye®Ⅱは50回(計500回の光照射)でもほとんど蛍光強度の変化が認められなかった。LipiDye®Ⅱが極めて高い光安定性を示し,長時間にわたるタイムラプスイメージング(Z-stackイメージング含む)に有用であることが示された。

LipiDye2の光安定性


細胞毒性

細胞毒性 (クリックで展開します)

3T3-L1脂肪細胞を各濃度のLipiDye®Ⅱで処理し,24時間後の細胞生存性をMTTアッセイで評価した。本試薬の推奨使用濃度は0.1~1μMだが,少なくとも5μMまで細胞毒性は観察されなかった。10μM以上で細胞毒性が観察された。

LipiDye2の細胞毒性


生細胞・固定細胞染色

生細胞・固定細胞染色 (クリックで展開します)

生細胞状態の3T3-L1脂肪細胞をLipiDye®Ⅱで染色後,生細胞で蛍光観察を行った(左)。その後,4%パラホルムアルデヒドで細胞を固定し洗浄した後,固定状態で再度蛍光観察を行った(右)。固定処理前後で蛍光シグナルの変化はほとんど見られなかった。本試薬は生細胞で染色・観察後,固定して免疫染色にも利用可能であることが示された。

生細胞・固定細胞染色


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アプリケーションデータ

様々な細胞での染色

3T3-L1,HepG2,COS-7,HeLa細胞それぞれをLipiDye®Ⅱ(1μM)で染色し,共焦点レーザー顕微鏡で緑色蛍光(励起473 nm/蛍光490~540 nm)を観察した(スケールバー:20μm)。HepG2は脂肪滴形成のために脂肪酸で1日間処理した。HeLa細胞では1μm以下の小さな脂肪滴が明瞭に観察できた(HeLa細胞拡大図(右側)参照,スケールバー:5μm)。

様々な細胞での染色


小胞体(ER)マーカーとのマルチカラーイメージング

小胞体(ER)局在性赤色蛍光タンパク質(ER-mKO1)を発現させたCOS-7細胞をLipiDye®Ⅱ(1μM)で染色し,共焦点レーザー顕微鏡で蛍光観察(LipiDye®Ⅱ:励起473 nm/蛍光490~540 nm,ER-mKO1:励起559 nm/蛍光570~620 nm)した。COS-7細胞の内在性の小さな脂肪滴(<1μm)が観察され,その多くがERの網目構造の内側に局在することが観察された(右側拡大図参照,スケールバー:1μm)。この結果は,脂肪滴がERから生合成されることとよく一致する。

小胞体(ER)マーカーとのマルチカラーイメージング


脂肪細胞の分化過程の長時間観察

脂肪前駆細胞3T3-L1を脂肪細胞に分化誘導する際の脂肪滴成熟の様子を,8日間にわたりLipiDye®Ⅱ(1μM)を用いて共焦点レーザー顕微鏡で生細胞観察した(励起473 nm/蛍光490~540 nm)。3T3-L1細胞を最初の2日間LipiDye®Ⅱ(1μM)を含む分化培地で培養した後,2日おきにLipiDye®Ⅱ(1μM)を含む維持培地に交換し,合計8日間蛍光観察した。LipiDye®Ⅱで長期間処理しても,細胞毒性や脂肪細胞分化に影響を及ぼすことなく脂肪滴成熟過程を観察することができた。

脂肪細胞の分化過程の長時間観察


生細胞イメージングによる新生脂肪滴の動的挙動解析

脂肪前駆細胞3T3-L1を脂肪細胞に分化誘導する際に新生した脂肪滴の動的挙動を,長時間タイムラプスイメージング(Z-stackイメージング)で約24時間(共焦点レーザー顕微鏡:励起473 nm/蛍光490~540 nm,10分毎の撮影,Z-stack 20枚/回)観察した。あらかじめLipiDye®Ⅱで染色した脂肪前駆細胞に分化培地(LipiDye®Ⅱを含む)を添加した直後からタイムラプスイメージングを開始した。分化誘導後10時間程度経過した頃から小さな脂肪滴が見えはじめ(650 min,白矢印),個々の脂肪滴は互いに相互作用しながら大きくなっていく様子が観察された(950~1,450 min,黄色矢印)。

生細胞イメージングによる新生脂肪滴の動的挙動解析


脂肪滴分解・新生プロセスの経時的観察

分化誘導した3T3-L1細胞にアデニル酸シクラーゼ活性化物質であるForskolin(10μM)およびホスホジエステラーゼ阻害物質IBMX(100 nM)を添加し,トリアシルグリセロール分解に伴う脂肪滴の縮小過程をLipiDye®Ⅱを用いたタイムラプスイメージング(Z-stackイメージング)で観察した(共焦点レーザー顕微鏡:励起473 nm/蛍光490~540 nm,800分間,4分毎の撮影,Z-stack 15枚/回)。もともと存在した大きな脂肪滴(白矢印参照)は時間依存的に小さくなっていることが確認できる。また,時間依存的に小さな脂肪滴(黄色三角)が多数生成していることが分かる。
LipiDye®Ⅱは極めて高い光安定性を有することにより退色の心配がなく,高いS / N比を示すことにより微小の新生脂肪滴も観察できるため,脂肪滴の増減を定量的に観察可能であることが示された。

脂肪滴分解・新生プロセスの経時的観察


STED超高解像度顕微鏡による微小脂肪滴の可視化

HeLa細胞をLipiDye®Ⅱ(1μM)で染色し,共焦点レーザー顕微鏡(励起473 nm/蛍光490~540 nm)およびSTED超高解像度顕微鏡(励起473 nm+STED 660 nm/蛍光500~640 nm)で微小脂肪滴の観察を試みた。STED観察像はDeconvolution処理を行ったデータを示している。共焦点レーザー顕微鏡では不明瞭な微小脂肪滴が,STED顕微鏡では明瞭に確認され,半値幅(FWHM)は約120 nmであった。
STED顕微鏡の観察条件および解析方法は原著論文をご参照下さい。

STED超高解像度顕微鏡による微小脂肪滴の可視化

二光子顕微鏡によるミクログリアの観察

ラット初代培養ミクログリアにLipiDye®Ⅱ(1μM)を添加し終夜染色後,4% PFAで固定し二光子顕微鏡(励起 800 nm/蛍光 510~560 nm)で観察した。LipiDye®Ⅱは二光子励起法でも励起が可能で,初代培養ミクログリアにおける大小さまざまなサイズの脂肪滴を検出できた。

二光子顕微鏡によるミクログリアの観察

(データ提供:Dr. Hyun Beom Choiおよび Dr. Brian MacVicar, The University of British Columbia)



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価格

[在庫・価格 :2021年09月17日 08時51分現在]

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詳細 商品名
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納期 文献数
LipiDye II <Live Imaging>
1週間程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 0
説明文
長時間の生細胞イメージングに優れた高感度な脂肪滴(Lipid droplet)の染色試薬。高い脂肪滴特異性に加え,低毒性かつ極めて高い光安定性を誇り,数日単位の長時間観察や脂肪滴融合・分解プロセスの生細胞イメージング,超高解像度顕微鏡での超微小脂肪滴の可視化に有用。(励起400~500 nm/蛍光490~550 nm)。
法規制等
保存条件 室温 法規備考
掲載カタログ ニュース2021年6月1日号 p.14
ニュース2021年5月15日号 p.20

製品記事 生細胞用オルガネライメージング試薬
脂質研究用製品特集
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LipiDye II <Live Imaging>

文献数:0

説明文 長時間の生細胞イメージングに優れた高感度な脂肪滴(Lipid droplet)の染色試薬。高い脂肪滴特異性に加え,低毒性かつ極めて高い光安定性を誇り,数日単位の長時間観察や脂肪滴融合・分解プロセスの生細胞イメージング,超高解像度顕微鏡での超微小脂肪滴の可視化に有用。(励起400~500 nm/蛍光490~550 nm)。
法規制等
保存条件 室温 法規備考
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ニュース2021年5月15日号 p.20

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従来製品:LipiDye®

従来製品のLipiDye®も継続してお買い求めいただけます。製品の詳細についてはこちらをご覧下さい。

LipiDye®について (クリックで展開します)

特長

  • 励起/蛍光波長:350~470 nm/500~600 nm
    推奨励起光:405 nm,蛍光測定波長:490~550 nm
  • 脂肪滴選択的に濃縮し,さらに溶媒の疎水性環境に応答して発光する蛍光色素のため,細胞質での発光が抑えられ脂肪滴に高いS / N比を示します。
  • 非脂肪細胞の小さな脂肪滴の検出に優れています。
  • 推奨使用濃度(0.1~1μM)ではほとんど細胞毒性を示しません。
  • 生細胞,固定細胞のいずれにも使用可能です。生細胞染色後の固定処理も可能です。

一般的な緑色蛍光色素用の励起フィルター(FITCやGFP)では十分な励起ができない恐れがあります(下記,励起/蛍光スペクトル参照)。適切な励起フィルターをご選択下さい。詳細は当社テクニカルサポート(試薬担当)までお問い合わせ下さい。


原著論文

"Environment-sensitive fluorescent probe: a benzophosphole oxide with an electron-donating substituent"
Yamaguchi, E., et al., Angew. Chem. Int. Ed., 54 (15), 4539 (2015). [PMID:25740735]


参考データ:励起/蛍光スペクトル

LipiDye®は溶媒極性応答性色素で,溶媒によりスペクトルが大きく異なります。下図は脂肪滴に近いTolueneでのスペクトルデータです。

LipiDyeの蛍光スペクトル

Nile Redとの比較

脂肪細胞の脂肪滴をLipiDye®またはNile Redで染色し,それぞれについて左図中の矢印で示した範囲の蛍光強度を測定した(右図)。その結果,Nile RedよりもLipiDye®の方が感度もS / N比も高かった。脂肪滴での蛍光強度はLipiDye®の方が強く(distance 0~10μm),細胞質での非特異的な蛍光シグナルもNileRedに比べ大きく抑えられていた(10~20μm)。

Nile Redとの比較

細胞毒性の検証

LipiDye®を各濃度で3T3-L1脂肪細胞に処理し,24時間後の細胞生存性をMTTアッセイで評価した。LipiDye®の推奨使用濃度は0.1~1 μMだが,少なくとも2 μMまで細胞毒性は観察されなかった。

LipiDyeの細胞毒性の検証

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LipiDye <Lipid Droplet Green>
1週間程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 0
説明文
脂肪滴(Lipid droplet)を高感度に染色する蛍光色素です。従来の脂肪滴検出色素であるNile Redに比べて高いS/N比を示します。生細胞・固定細胞ともに使用可能です。Excitation/Emission:405 nm/521-530 nm。
法規制等
保存条件 室温 法規備考
掲載カタログ ニュース2020年6月15日号 p.24
ニュース2020年4月1日号 p.24

製品記事 イメージング解析用プローブ(細胞用)特集
NAFLD / NASH研究用試薬
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[在庫・価格 :2021年09月17日 08時51分現在]

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LipiDye <Lipid Droplet Green>

文献数:0

説明文 脂肪滴(Lipid droplet)を高感度に染色する蛍光色素です。従来の脂肪滴検出色素であるNile Redに比べて高いS/N比を示します。生細胞・固定細胞ともに使用可能です。Excitation/Emission:405 nm/521-530 nm。
法規制等
保存条件 室温 法規備考
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ニュース2020年4月1日号 p.24

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(テクニカルサポート 試薬担当)

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