高感度な脂肪滴長時間イメージング試薬 LipiDye^®Ⅱ

長時間の生細胞イメージングに優れた高感度な脂肪滴染色試薬です。高い脂肪滴特異性に加え，低毒性かつ極めて高い光安定性を誇り，数日単位の長時間観察や脂肪滴融合・分解プロセスの生細胞イメージング，超高解像度顕微鏡での超微小脂肪滴の可視化に有用です。

※ 本製品は名古屋大学 トランスフォーマティブ生命分子研究所　山口茂弘教授，多喜正泰特任准教授の研究成果をもとに，フナコシ株式会社が製品化し，販売しています。
※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

LipiDye^®Ⅱによる脂肪細胞および非脂肪細胞の染色例

励起／蛍光波長：400～500 nm／490～600 nm
※ 吸収極大 410～420 nmですが，450～500 nm領域の光源でも励起可能です。詳しくは励起・蛍光スペクトルデータをご参照下さい。
※ 800 nmレーザーによる二光子励起が可能です。詳しくは二光子顕微鏡によるミクログリアの観察をご参照下さい。
※ 多重染色も可能ですが，波長選択について注意が必要です。励起光が500 nm以上の色素をご使用下さい。450 nm以下の領域で励起する一般的な青色蛍光色素を用いた場合，本試薬も同時励起される可能性があります。

■ 光源例

"Fused Thiophene-S,S-dioxide-Based Super-Photostable Fluorescent Marker for Lipid Droplets."
Taki, M., et al., ACS Mater. Lett., 3(1), 42～49 (2021)

LipiDye^®Ⅱは溶媒環境応答性蛍光色素（Solvatochromic dye）で，周囲の分子極性に応じて蛍光波長が変化します。吸収スペクトルは溶媒にほとんど影響を受けず，380～500 nmに吸収が見られます（図A）。

　　・推奨励起光：405 nm, 445 nm, 458 nm, 473 nmレーザー
　　・使用可能励起光：488 nmレーザー（蛍光強度が弱いため，実験ごとに使用濃度等の検証を推奨しています。）

一方，蛍光スペクトルは溶媒極性に大きく依存し，TolueneやDichloromethaneなどの疎水性環境下では強い青～緑色蛍光を示しますが，Acetonitrile，DMSOや水溶液といった高極性環境では極性が大きくなるほど蛍光極大は長波長側にシフトし蛍光強度は著しく抑制されます（図B）。この特性により，脂肪滴の疎水性環境特異的な緑色蛍光が観察できます。
LipiDye^®Ⅱで細胞を染色し，脂肪滴部分を顕微鏡でスペクトルスキャンして脂肪滴での蛍光を評価すると，500 nm付近を極大とする蛍光スペクトルが観察されています（図C）。
※ 図A～Cいずれも灰色網掛け領域が推奨の励起・蛍光波長。

4％パラホルムアルデヒドで固定処理した3T3-L1脂肪細胞を，新製品LipiDye^®Ⅱ，従来製品LipiDye^®および従来の蛍光色素Bで染色後，共焦点レーザー顕微鏡によるZ-stackイメージング（励起：473 nm／蛍光：490～540 nm）を繰り返し行い，蛍光強度の推移を観察した。Z-stackイメージングでは1回の撮影当たり2μmずつ10枚取得した。従来色素Bが約5回のZ-stackイメージングで著しく傾向が減衰したのに対して，従来製品LipiDye^®は耐光性を示すものの，徐々に減衰が見られ50回のZ-stackイメージング後は約60%程度まで蛍光減衰が認められた。
一方で本試薬LipiDye^®Ⅱは50回（計500回の光照射）でもほとんど蛍光強度の変化が認められなかった。LipiDye^®Ⅱが極めて高い光安定性を示し，長時間にわたるタイムラプスイメージング（Z-stackイメージング含む）に有用であることが示された。

3T3-L1，HepG2，COS-7，HeLa細胞それぞれをLipiDye^®Ⅱ（1μM）で染色し，共焦点レーザー顕微鏡で緑色蛍光（励起473 nm／蛍光490～540 nm）を観察した（スケールバー：20μm）。HepG2細胞は脂肪滴形成のために脂肪酸で1日間処理した。HeLa細胞では1μm以下の小さな脂肪滴が明瞭に観察できた（HeLa細胞拡大図（右側）参照，スケールバー：5μm）。

小胞体（ER）局在性赤色蛍光タンパク質（ER-mKO1）を発現させたCOS-7細胞をLipiDye^®Ⅱ（1μM）で染色し，共焦点レーザー顕微鏡で蛍光観察（LipiDye^®Ⅱ：励起473 nm／蛍光490～540 nm，ER-mKO1：励起559 nm／蛍光570～620 nm）した。COS-7細胞の内在性の小さな脂肪滴（<1μm）が観察され，その多くがERの網目構造の内側に局在することが観察された（右側拡大図参照，スケールバー：1μm）。この結果は，脂肪滴がERから生合成されることとよく一致する。

脂肪前駆細胞3T3-L1を脂肪細胞に分化誘導する際の脂肪滴成熟の様子を，8日間にわたりLipiDye^®Ⅱ（1μM）を用いて共焦点レーザー顕微鏡で生細胞観察した（励起473 nm／蛍光490～540 nm）。3T3-L1細胞を最初の2日間LipiDye^®Ⅱ（1μM）を含む分化培地で培養した後，2日おきにLipiDye^®Ⅱ（1μM）を含む維持培地に交換し，合計8日間蛍光観察した。LipiDye^®Ⅱで長期間処理しても，細胞毒性や脂肪細胞分化に影響を及ぼすことなく脂肪滴成熟過程を観察することができた。

脂肪前駆細胞3T3-L1を脂肪細胞に分化誘導する際に新生した脂肪滴の動的挙動を，長時間タイムラプスイメージング（Z-stackイメージング）で約24時間（共焦点レーザー顕微鏡：励起473 nm／蛍光490～540 nm，10分毎の撮影，Z-stack 20枚／回）観察した。あらかじめLipiDye^®Ⅱで染色した脂肪前駆細胞に分化培地（LipiDye^®Ⅱを含む）を添加した直後からタイムラプスイメージングを開始した。分化誘導後10時間程度経過した頃から小さな脂肪滴が見えはじめ（650 min，白矢印），個々の脂肪滴は互いに相互作用しながら大きくなっていく様子が観察された（950～1,450 min，黄色矢印）。

分化誘導した3T3-L1細胞にアデニル酸シクラーゼ活性化物質であるForskolin（10μM）およびホスホジエステラーゼ阻害物質IBMX（100 nM）を添加し，トリアシルグリセロール分解に伴う脂肪滴の縮小過程をLipiDye^®Ⅱを用いたタイムラプスイメージング（Z-stackイメージング）で観察した（共焦点レーザー顕微鏡：励起473 nm／蛍光490～540 nm，800分間，4分毎の撮影，Z-stack 15枚／回）。もともと存在した大きな脂肪滴（白矢印参照）は時間依存的に小さくなっていることが確認できる。また，時間依存的に小さな脂肪滴（黄色三角）が多数生成していることが分かる。
LipiDye^®Ⅱは極めて高い光安定性を有することにより退色の心配がなく，高いS / N比を示すことにより微小の新生脂肪滴も観察できるため，脂肪滴の増減を定量的に観察可能であることが示された。

HeLa細胞をLipiDye^®Ⅱ（1μM）で染色し，共焦点レーザー顕微鏡（励起473 nm／蛍光490～540 nm）およびSTED超高解像度顕微鏡（励起473 nm＋STED 660 nm／蛍光500～640 nm）で微小脂肪滴の観察を試みた。STED観察像はDeconvolution処理を行ったデータを示している。共焦点レーザー顕微鏡では不明瞭な微小脂肪滴が，STED顕微鏡では明瞭に確認され，半値幅（FWHM）は約120 nmであった。
※ STED顕微鏡の観察条件および解析方法は原著論文をご参照下さい。

ラット初代培養ミクログリアにLipiDye^®Ⅱ（1μM）を添加し終夜染色後，4% PFAで固定し二光子顕微鏡（励起　800 nm／蛍光 510～560 nm）で観察した。LipiDye^®Ⅱは二光子励起法でも励起が可能で，初代培養ミクログリアにおける大小さまざまなサイズの脂肪滴を検出できた。

（データ提供：Dr. Hyun Beom Choiおよび Dr. Brian MacVicar, The University of British Columbia）

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