免疫蛍光染色（IF）の原理と基本プロトコル

免疫蛍光染色（IF）とは

免疫蛍光染色概略

1．試料の作製

培養細胞試料

パラフィン包埋切片試料

メーカー	特長
サクラファインテックジャパン（株） ［メーカー略称：SFJ］	品名：ティシュー・テック® ユニ・カセット／包埋皿 組織片の固定・薄切・保存までの全プロセスを、効率的に処理できるフタ付きカセットです。さまざまなタイプのご用意があります。
サクラファインテックジャパン（株） ［メーカー略称：SFJ］	品名：ティシュー・テック パラフィン ワックス II60 融点が高くベ夕つきにくいため薄切片を容易に作製できる、組織包埋に適したパラフィンワックスです。

凍結包埋／クリオスタット切片試料

メーカー	特長
サクラファインテックジャパン（株） ［メーカー略称：SFJ］	品名：ティシュー・テック クリオモルド プラスチック製包埋皿 凍結切片作製用の包埋皿です。組織サイズに応じて角型3種類、丸型2種類の製品があります。
サクラファインテックジャパン（株） ［メーカー略称：SFJ］	品名：凍結組織切片作製用包埋剤 ティシュー・テック O.C.T. コンパウンド O.C.T. コンパウンド（Optimal Cutting Temperature Compound）は、世界中で使用されている定番の凍結切片作製用の包埋剤です。速やかに包埋できます。

2．固定

ホルムアルデヒド（Formaldehyde）

メーカー	特長
サクラファインテックジャパン（株） ［メーカー略称：SFJ］	品名：ティシュー・テック® ホルマGO™シリーズ 凍結切片作製用の包埋皿です。組織サイズに応じて角型3種類、丸型2種類の製品があります。

アルコール

アセトン

組織の固定

培養細胞の固定

メーカー	特長
Polysciences, Inc. ［メーカー略称：POL］	品名：各種固定剤

3．抗原の賦活化

メーカー	特長
Polysciences, Inc. ［メーカー略称：POL］	品名：G-Activate（免疫組織化学染色試薬） パラフィン包埋切片を用いた免疫染色での熱処理時に使用する抗原賦活化バッファ―で、pH6のクエン酸バッファー、pH9のEDTAバッファーの2種類があります。

4．透過処理

5．蛍光抗体法

直接法（Direct）

間接法（Indirect）

蛍光色素とは

蛍光スペクトルビューアー

蛍光スペクトルビューアーのイメージ図です

蛍光色素検索システム

蛍光色素検索システムのイメージ図です

免疫蛍光染色（IF）のプロトコル

接着細胞

• カバースリップはエタノールでよく洗うか、クリーンベンチ内のUVライトで最低1時間滅菌をする。

• 滅菌状態を保ったまま、50～100 μg/mlのポリ-L-リジンで室温1時間でインキュベーションする。
• 滅菌水で3回洗う。
• クリーンベンチ内で一晩乾燥させ、UVライトで4時間以上照射させ滅菌する。

メーカー	特長
Everest Biotech Ltd. ［メーカー略称：EBL］	品名：Shi-fix Coverslip / Coated Plate 独自のコーティングにより、浮遊細胞を簡便に固定することができるデバイスです。固定した浮遊細胞は、接着細胞のように操作することができます。お手持ちの12ウェルプレート用のカバースリップと、ウェル底面を独自コーティングした96ウェルプレートがあります。

• コーティングしたカバースリップを培養プレート中に置く（12ウェルプレートは丸型18 mmカバースリップ、24ウェルプレートでは丸型12 mmカバースリップ）。
• カバースリップ上に細胞を移し、50～70％コンフルエントになるまで一晩または2～3日間培養する。

• 培養液を吸引除去した後、細胞をPBSで2回洗う。
• 細胞を2～4％パラホルムアルデヒド（PFA）で室温10～20分間、または－20℃で冷メタノール、アセトン（1～10分間）で固定する。
• 細胞をPBSで5分間、3回洗う。

メーカー	特長
Bioenno Tech LLC ［メーカー略称：BIE］	品名：4％ Paraformaldehyde in 0.1 M Phosphate Buffer 動物の灌流固定および組織構造の保存に最適なメタノールフリーの組織固定液（4％パラホルムアルデヒド／PB）です。主に脳組織、培養細胞、組織などの形態保持に使用することができます。

• PBSを吸引除去した後、0.05～0.25%のTriton X-100/PBS（または100 μMジギトニンまたは0.5%のサポニン）を加え、10～15分間インキュベーションする。
• 細胞をPBSで5分間、3回洗う。
  ※ メタノールやアセトンで固定した細胞は、透過処理の必要はありません。
  ※ 細胞膜表面タンパク質が標的である場合は、透過処理の必要はありません。
  ※ 細胞内タンパク質が標的である場合は必ず透過処理をして下さい。
  ※ Triton X-100は透過処理に最も広く用いられている界面活性剤ですが、細胞膜に大きなダメージを与えます。細胞膜上に存在する標的を同時に染色する場合には100 μMジギトニンまたは0.5%のサポニン、NP-40、Tween-20で透過処理を行って下さい。

• Triton X-100
• ジギトニン（Digitonin）
• NP-40
• Tween-20

• PBSを吸引除去した後、1～3%のBSA/PBS（ブロッキングバッファー）で細胞を30～60分間インキュベートする。

メーカー	特長
LGC Clinical Diagnostics, Inc (SeraCare) ［メーカー略称：KPL］	品名：ブロッキング試薬 各種ブロッキング試薬です。免疫組織染色、ELISA、ウエスタンブロッティング用としてマウス、ヤギ、ウサギの血清と、内在性ペルオキシダーゼやホスファターゼを抑えることができる免疫組織染色用としてユニバーサルブロッキング試薬があります。
VECTOR LABORATORIES, INC. ［メーカー略称：VEC］	品名：ブロッキング試薬 VECTOR社のVECTASTAIN ABC Kitの関連試薬です。

• ブロッキングバッファーを吸引除去した後、適切なバッファーで希釈した一次抗体で細胞をインキュベーションする。室温の場合は1～4時間、4℃の場合は一晩。
• 細胞をPBSで5分間、3回洗う。

メーカー	特長
フナコシ（株） ［メーカー略称：FUN］	フナコシの抗体検索サイト フナコシ株式会社の抗体検索サイトです。抗体の絞り込み検索、オススメ抗体メーカー、抗体の抗原名の他、各社の商品コードでも抗体をお探しいただけます。

• PBSを吸引除去した後、適切なバッファーで希釈した二次抗体で細胞を室温で30～60分間インキュベーションする。
• 細胞をPBSで5分間、3回洗う。

メーカー	特長
R&D Systems, Inc. ［メーカー略称：RSD］	品名：NorthernLights標識二次抗体 強い蛍光を発し、退色しにくく、アルコールやキシレンを含む溶液中でも安定な蛍光色素であるNorthernLights（NL）を結合した二次抗体とストレプトアビジンです。
Bethyl Laboratories, Inc. ［メーカー略称：BET］	品名：DyLightシリーズ／Cyシリーズ蛍光標識二次抗体 抗ヒト／マウス／ウサギ／ラットに対する蛍光標識二次抗体です。
Rockland Immunochemicals, Inc. ［メーカー略称：RCK］	Anti-Mouse Secondary Antibody（抗マウス二次抗体） Anti-Rabbit Secondary Antibody（抗ウサギ二次抗体） Anti-Goat Secondary Antibody（抗ヤギ二次抗体） Anti-Human Secondary Antibody（抗ヒト二次抗体） Anti-Rat Secondary Antibody（抗ラット二次抗体） Anti-Animal Secondary Antibody（抗その他の動物種二次抗体）
Rockland Immunochemicals, Inc. ［メーカー略称：RCK］	品名：近赤外（NIR）蛍光標識二次抗体 DyLightシリーズを用いた、近赤外（NIR：near-infrared, far-red）蛍光イメージング用の蛍光標識抗体をご紹介します。Rockland社の蛍光標識二次抗体は、マルチプレックス検出用に交差吸収処理されているものが多く、イムノブロッティング、マルチプレックスイメージング、ELISA、顕微鏡、小動物におけるin vivoイメージングなどの様々な用途で高感度、優れたS/N比、高い特異性を示すよう最適化されています。
BioActs (DKC Corporation) ［メーカー略称：BAA］	品名：FSD Fluorシリーズ蛍光標識二次抗体 免疫動物がヤギおよびウサギの蛍光標識済み二次抗体です。優れた蛍光強度を有し、標識後も安定した蛍光性を維持するBioActs社オリジナルの蛍光色素（FSD Fluorシリーズ）が標識されています。

• 0.5 μg/mlのDAPI/PBSまたは0.1～12 μg/mlのHoechst/PBSで核を5～10分間染色する。
• 細胞をPBSで5分間、2回洗う。

• DAPI
• Hoechst33342
• Propidium Iodide（PI）


10．封入
• カバースリップ上のPBSを毛羽立っていない紙やペーパータオルで吸い取り、できるだけPBSを除去する。
• スライドガラスにマウンティングメディウムを少量滴下する。
• 気泡が入らないように、カバースリップをスライドガラスにゆっくりのせる。
• カバースリップをマニキュアなどでスライドガラスにシールし、自然乾燥させる。
• スライドは遮光した箱に入れて4℃で保管する。

■封入剤のラインナップ
項目をクリックすると該当するWeb記事をご覧いただけます。

メーカー	特長
VECTOR LABORATORIES, INC. ［メーカー略称：VEC］	品名：VECTASHIELD PLUS Antifade Mounting Medium 固化しないタイプの蛍光染色用封入剤です。自家蛍光が生じず、バックグラウンドが低く抑えられます。また、Cy5などの遠赤色領域のスペクトルを有する蛍光の観察に優れています。細胞／組織切片における蛍光タンパク質および蛍光色素の急速な光退色を防ぎます。
VECTOR LABORATORIES, INC. ［メーカー略称：VEC］	品名：VECTASHIELD Mounting Medium VECTASTAIN ABC KitでおなじみのVector Laboratories社の蛍光染色用封入剤です。固化しないVECTASHIELDおよびVECTASHIELD PLUSと、固化するVECTASHIELD Hard・SetおよびVECTASHIELD Vibranceの4種類があり、いずれも水溶性です。
VECTOR LABORATORIES, INC. ［メーカー略称：VEC］	品名：VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium 新しい組成の蛍光染色用封入剤で、封入後1時間で切片の観察ができます。室温で数時間かけて固化し、細胞／組織切片における蛍光タンパク質および蛍光色素の急速な光退色を防ぎます。お客様からのフィードバックをもとに、使いやすさやシグナル強度の保持などの点を改良しました。
LGC Clinical Diagnostics, Inc (SeraCare) ［メーカー略称：KPL］	品名：Fluorescent Mounting Media 蛍光免疫染色や蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）に使用できる蛍光顕微鏡用の封入剤です。
Bioenno Tech LLC ［メーカー略称：BIE］	品名：Slide Mount パラホルムアルデヒド（PFA）固定脳切片の免疫蛍光染色においてバックグラウンドを抑え、蛍光標識を安定して保持できる水系封入剤です。退色防止剤が含まれており、一般的な蛍光色素の消光および光による退色を防止します。製品ラインナップとして、対比染色用色素が含まれていないSlide Mount for Fluorescent Labelingと、核および染色体の対比染色用色素があらかじめ添加されているSlide Mount -with DAPI（DAPI含有：青色）、-with Green Counterstain（SYTOX Green含有：緑色）, -Far-red Counterstain（TO-PRO-3含有：遠赤色）があります。