抗体染色／除去（剥離）を最大6回行える抗体除去キット（免疫染色用ストリッピングバッファー） VectaPlex Antibody Removal Kit

免疫組織化学染色（IHC）、免疫蛍光染色（IF）またはチラミドシグナル増幅（TSA）染色において、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織切片から、抗体や非共有結合した試薬を除去するためのReady-to-useのキットです。抗体除去反応は室温で行い、染色・除去を複数回繰り返しても組織の形態や抗原性への影響を最小限に抑えることができます。Leica BOND RX自動染色装置を用いたマルチプレックスIHCワークフローでの使用例も報告されており、自動染色装置を用いた高再現性・高スループットな多重染色にも応用できます。
※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）胃組織切片の免疫蛍光染色像
CD20（赤色）、CD3（灰色）、CD34（黄色）、AE1/AE3（赤紫色）、Vimentin（緑色）、Desmin（青緑色）に対するる6種類のマウス一次抗体、DyLight488標識ウマ抗マウスIgGを使用し得られた染色像（左図）と重ね合わせた複合画像（右図）。最初の一次抗体で染色・イメージング後、本製品を用いて抗体を除去し、次の抗体の染色～除去を繰り返した。各染色にはVECTASHIELD PLUS with DAPI（#H-2000）を用い、退色を防ぎながら対比染色を行った。

＊1 下記のVECTOR LABORATORIES社の基質はVectaPlexでの処理を検証し、使用できることを確認しています。他メーカーの基質での使用については、FAQの「Q-2.他メーカーの基質も本製品と使用できますか。」をご覧下さい。

＊2 本製品は、さまざまなFFPE試料および染色条件で使用できるように開発され、最大6回まで連続して染色と抗体除去ができることを検証済みです。ただし、使用する試料や実験法により除去のパフォーマンスが影響を受ける可能性があります。このため、対照実験として本製品を使用した場合と使用しない場合のシングルプレックス染色の実施を推奨します。

ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）乳がん組織切片（A）を、電子レンジで6回加熱処理を行った場合（B）、本製品で6回処理を行った場合（C）。それぞれのヘマトキシリン・エオジン（HE）染色像を示す。

＊3 各ステップではVectaPlexによる処理に適合した基質を使用する必要があります。

CD3（赤色）、CD68（緑色）、AE1/AE3（紫色）に対する3種類のマウス一次抗体およびOpal 3-Plex TSA Kit（Akoya Biosciences）、またはDAPI（青色）を使用し得られた染色像（左図）と重ね合わせた複合画像（右図）。最初の一次抗体で染色・イメージング後、本製品を用いて抗体を除去し、次の抗体の染色～除去を繰り返した。

CD68（茶色）、CD20（赤色）、CD34（青色）、およびDesmin（灰色）の四重染色像。本製品を用いて抗体を除去し、次の標的を染色する工程を3回繰り返した。

本製品をLeica BOND RX自動染色装置で使用し、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織切片を用いたマルチプレックス免疫組織化学染色（IHC）ワークフローへの適用性を検証した。Leica BOND RXは、IHCやIFなどの高スループットアプリケーションに使用されるオープンシステムの自動染色装置で、外部試薬を用いたカスタムワークフローにも対応している。

本検討では、CD34（青色、Vector Blue）、Vimentin（茶色、ImmPACT^® DAB）、S100（赤色、ImmPACT^® Vector Red）、CD20（灰色、ImmPACT^® SG）を、4回の連続染色により検出した。各染色後に本製品を用いて抗体および検出試薬を除去し、FFPEヒト子宮がん組織、FFPEヒト扁平上皮がん組織、およびFFPEヒト胃組織で評価した（それぞれの発色基質についてはこちらをご覧下さい）。

その結果、4回の連続染色後も組織構造が保持され、抗原特異的な染色強度および局在が維持されることが確認できた。また、バックグラウンドシグナルの増加やシグナルの持ち越しは認められず、抗体および検出試薬が効率よく除去されることが示された。

以下に、代表例としてFFPEヒト子宮がん組織を用いた4回連続染色像およびネガティブコントロールを示す。

左図：CD34（青色）、Vimentin（茶色）、S100（赤色）、CD20（灰色）を検出した4回連続染色像。
右図：一次抗体を添加せずに4回連続染色を行ったネガティブコントロール。20倍対物レンズで撮影。

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Q-1. 凍結切片試料に使えますか。
A-1. いいえ、できません。本製品はホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織切片用に最適化されており、室温で「抗体を除去する能力」と「組織形態を保存する能力」の兼ね合いが図られています。凍結切片の場合、本製品を使うと、スライドから組織切片が剥がれてしまいます。

Q-2. 他メーカーの基質も本製品と使用できますか。
A-2. おそらく可能ですが、VECTOR LABORATORIES社では他メーカーの基質との使用については、検証を行っていません。使用の可否を確認する場合、対象の試薬で2枚の切片を染色し、そのうち1枚を本製品で処理して下さい。染色強度が変わらなければ、その基質は使用できると考えられます。

Q-3. 免疫蛍光染色（IF）のプロトコルで、組織からの自家蛍光も除くことができますか。
A-3. いいえ、本製品では、自家蛍光のバックグラウンドを低減できません。自家蛍光の抑制には、Vector TrueVIEW^® Autofluorescence Quenching Kit（#SP-8400、#SP-8500（with DAPI））が効果的です＊4。
＊4 リポフスチン（lipofuscin）の自家蛍光を抑える効果はありません。

Q-4. 自家蛍光を抑制する目的でVector TrueVIEW^® Autofluorescence Quenching Kit（#SP-8400）を使用しています。TrueVIEW^®の効果は本製品で除去されてしまいますか。
A-4. 本製品の免疫蛍光染色（IF）ワークフローを用いて、自家蛍光を抑制する目的でTrueVIEW^®キットを使用した検討を行いました。本製品を使用すると、すべてではありませんがTrueVIEW^® キットの成分が除かれました。しかし、残存のTrueVIEW^® 試薬の効果があるため、全サイクルで添加する必要はなく、自家蛍光の抑制が必要な場合のみTrueVIEW^® 試薬を添加して下さい。

Q-5. 誤って冷凍庫に入れて凍らせてしまいました。まだ使用できますか。
A-5. はい、できます。本製品は凍結融解サイクルに耐えられる試薬ですが、保管温度は15～25℃を推奨します。また、4℃での保管も可能です。

Q-6. 切片1枚に対して、本製品の使用回数に上限はありますか。
A-6. 本製品は、1試料あたり6サイクルまで試験されています。サイクル数を増やしても問題はないと思われますが、適切な比較のために対照を置き、抗原性や組織形態に影響がないことを確認することをおすすめします。

Q-7. 自動染色装置で使用できますか。
A-7. はい、できます。本製品は自動化システムでの使用が検証されています。Leica BOND RX自動染色装置を用いたWhite Paperでは、FFPE組織切片を用いた4回の連続マルチプレックスIHC染色において、組織形態および抗原性を保持しながら、抗体および検出試薬を効率よく除去できることが示されています。

Q-8. すべての種の抗体で機能しますか。
A-8. 本製品は、マウスとウサギの一次抗体と、ウマとヤギの二次抗体で試験されていますが、他種の抗体でも同様に機能すると予想されます。

Q-9. 各組織で機能しますか。
A-9. 本製品は、非常に壊れやすい乳がん組織や肺組織のパラフィン包埋組織を始めとするさまざまなホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織試料で試験され、良好に機能することを確認しています。

Q-10. すべての抗体で機能しますか。
A-10. 本製品は、30種類を超える一般的な抗体で試験されており、問題なく機能しています。

Q-11. カバースリップを除去するプロトコルはありますか。
A-11. 水溶性非固化性封入剤であるVECTASHIELD PLUS Antifade Mounting Medium with DAPI（#H-2000）の使用をおすすめします。各イメージングサイクルの後、カバースリップはPBS中でインキュベートすることで簡単に除去でき、残ったVectaShieldはPBS洗浄で除かれます。