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AAVS1 SparQ All-In-One Inducible System
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AAVS1 SparQ All-In-One Inducible System
目的遺伝子をゲノム内の「安全な」遺伝子領域に組み込み、厳密な誘導発現を行えるキット AAVS1 SparQ All-In-One Inducible System
掲載日情報：2024/01/31 現在Webページ番号：70118
誘導基質Cumateの添加により目的遺伝子の厳密な誘導発現を行える発現カセットを、CRISPR/Cas9を用いて宿主細胞ゲノムのAAVS1セーフハーバーへ組み込む（インテグレートする）システムです。
目的遺伝子をクローニングするドナーベクターと、AAVS1に対するgRNAとCas9を発現するベクターのわずか2つのベクターで構成されており、操作は簡便です。
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原理
AAVS1部位へのSparQ All-Ine-One Expression Cassetteのノックイン
AAVS1部位へのSparQ All-Ine-One Expression Cassetteのノックイン
- Cas9は、AAVS1特異的なgRNAによりAAVS1部位の二本鎖DNAの切断（DSB、Doble-stranded break）を起こす。
- 生じたDSBがDNA修復機構により修復される。DSB（ゲノムおよびプラスミドDNAの青色の領域）の隣接領域と相同性を有するHRドナーの存在下では、非相同末端結合（NHEJ、Non-homologous end joining）よりも相同組換え（HR、Homologous recombination）が優先的に起こる。
- その結果、HRにより2つの相同性アーム間のHRドナーベクターの領域が挿入され、SparQ inducible expression casetteがAAVS1部位に組み込まれる。
Cumate Switch System
SpaQ Cumate Switch Systemでは，Cumateオペレーター配列（CuO）に強く結合しているCymRリプレッサーを介して発現のON/OFFが行われます。CymRリプレッサーにより遺伝子の発現が抑制されている状態（下図：Cumate Switch OFF）にCumateを加えると，CumateがCymRリプレッサーに結合しCymRリプレッサーがCuOから解離するため，遺伝子発現が起こります（下図：Cumate Switch ON）。
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特長
- CRISPR/Cas9の使用により、AAVS1セーフハーバー部位への発現カセットの精度高い組み込みが行えるため、信頼性の高い遺伝子制御を実現します。
- AAVS1セーフハーバー部位へ組み込んだ遺伝子の発現についてオン／オフを自由に行うことができます。
- オフターゲットなインテグレーションを最小限に抑えます。
- 目的遺伝子の誘導発現が可能なアイソジェニックな細胞株を効率的に樹立できます。
- All-In-One設計のため、発現カセットの組み込みから目的遺伝子の誘導発現までのプロセス全体を簡略化できます。
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製品ラインナップ
商品コードをクリックすると各製品の価格表、●をクリックするとキットコンポーネントの別売り単品の価格表をご覧いただけます。
| 品名 | AAVS1 SparQ All-In-One Inducible System | ||
|---|---|---|---|
| 商品コード | GEQM800A-Kit | GEQM820A-Kit | |
| キット内容 | AAVS1 SparQ All-In-One Inducible Donor Vector （AAVS1-SA-RFP-Puro-EF1-CymR-CuO-MCS） |
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| AAVS1 SparQ All-In-One Inducible Donor Vector （AAVS1-SA-RFP-Puro-EF1-CymR-CuO-MCS-P2A-GFP） |
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| All-in-one Cas9 SmartNuclease AAVS1 Targeting Plasmid | ● | ● | |
| Junction PCR Primer Mix（AAVS1部位挿入確認用） | ● | ● | |
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操作方法概略
目的遺伝子の誘導発現が可能なアイソジェニックな細胞株樹立のワークフロー
- Cas9およびAAVS1特異的gRNAを発現するAll-In-Oneベクター（#CAS601A-1）と、AAVS1 SparQ All-In-Oneドナーベクター（#GEQM800A-1）または（#GEQM820A-1）を標的細胞株にコトランスフェクションする。
- トランスフェクションの4～7日後、ピューロマイシンを用いて安定細胞株を選択する。
- フローサイトメトリーを使用してRFP陽性（RFP+）かつGFP陰性（GFP−）な細胞を単一細胞ソーティングする。
- Junction PCRを行い、AAVS1部位への正確な組み込みを検証する。
- Cumateの添加・除去により、目的遺伝子の発現を誘導・抑制する。
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使用例
AAVS1 SpaQ Inducible Systemを用いて樹立したクローン化細胞株
AAVS1 SpaQ Inducible Systemを用いて樹立したクローン化細胞株
#GEQM820A-1および#CAS601A-1をHEK293細胞にコトランスフェクションした。ピューロマイシン（1 μg/ml）選択後にフローサイトメトリーにより、RFP+かつGFP−な細胞の単一細胞ソーティングを実施した。
AAVS1部位へのSpaQ All-In-One発現カセット組み込みのJunction PCRによる確認
A．Junction PCRのプライマーデザイン
#GEQM820A-1および#CAS601A-1をHEK293細胞にコトランスフェクションした。ピューロマイシン（1 μg/ml）選択後（下記B）にフローサイトメトリーにより単一細胞ソーティングを実施し、個々のクローン細胞株を樹立した（下記C）。B、Cについて、Junction PCRを使用して、AAVS1部位へ発現カセットが正確に組み込まれたかを確認した。
B. プールしたピューロマイシン耐性細胞に対するJunction PCRによる確認
C. クローン化細胞株に対するJunction PCRによる確認
- Clone 1：ゲノムDNAが低濃度または品質不良
- Clone 2～7：発現カセットが組み込まれたクローン
- Clone 8：カセット組み込みが疑わしいクローン
- ←：Junction PCRアンプリコン
可逆性な遺伝子誘導発現の確認
可逆性な遺伝子誘導発現の確認
#GEQM820A-1を用いて樹立した安定細胞株（左上）に30 μg/mlの濃度でCumateを添加（Cumate+）し、1日後にGFP発現が誘導されたことを確認した（右上の画像はCumate添加2日後に撮影したもの）。培養液からCumateを除去（Cumate−）すると、GFPの発現は徐々に減少し（右下）、Cumateを培地に再び添加すると、GFP発現が再度誘導された（左下）。
AAVS1 SparQ All-in-One Systemにより樹立した細胞株における厳密な遺伝子誘導発現および抑制
AAVS1 SparQ All-in-One Systemにより樹立した細胞株における厳密な遺伝子誘導発現および抑制
#GEQM820A-1を用いて樹立した安定細胞株に、さまざまな濃度のCumateを添加してGFP発現を誘導した。Cumateを添加1日後（上段）および2日後（中段）に撮影した。3日目にCumateを培地から除去すると、それに応じてGFP発現が徐々に減少した（下段の画像はCumate除去3日後に撮影したもの）。
関連製品
品名をクリックすると製品の詳細をご覧いただけます。
| 品名 | 製品概要 |
|---|---|
| ☞ SparQ2 Cumate Switch System | レンチウイルスベクターを用いた遺伝子発現システムで，哺乳動物細胞において，誘導基質Cumateの添加により目的遺伝子とレポーター遺伝子の誘導発現を可逆的に制御することができます。 |
| ☞ PrecisionX Cas9 SmartNuclease All-in-one Vectors | セーフハーバー（AAVS1）ノックイン用のCas9のAll-in-Oneベクターです。 |
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価格
[在庫・価格 ：2024年04月28日 00時00分現在]
| 詳細 | 商品名 |
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文献数 | ||
|---|---|---|---|---|---|
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AAVS1 SparQ All-In-One Inducible System #GEQM800A-1 with #CAS601A-1 and #GEQM840PR-1 |
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AAVS1 SparQ All-In-One Inducible System #GEQM820A-1 with #CAS601A-1 and #GEQM840PR-1 |
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[在庫・価格 ：2024年04月28日 00時00分現在]
AAVS1 SparQ All-In-One Inducible System #GEQM800A-1 with #CAS601A-1 and #GEQM840PR-1
文献数： 0
- 商品コード：GEQM800A-Kit
- メーカー：SBI
- 包装：1kit
- 価格：¥491,000
- 在庫：無(未発注)
- 納期：10日程度 ※※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。
- 法規制等：
AAVS1 SparQ All-In-One Inducible System #GEQM820A-1 with #CAS601A-1 and #GEQM840PR-1
文献数： 0
- 商品コード：GEQM820A-Kit
- メーカー：SBI
- 包装：1kit
- 価格：¥491,000
- 在庫：無(未発注)
- 納期：10日程度 ※※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。
- 法規制等：
システム構成品の別売り単品
AAVS1 SparQ All-In-One Inducible Donor Vector
[在庫・価格 ：2024年04月28日 00時00分現在]
| 詳細 | 商品名 |
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文献数 | ||
|---|---|---|---|---|---|
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AAVS1 SparQ All-In-One Inducible Donor Vector (AAVS1-SA-RFP-Puro-EF1-CymR-CuO-MCS) |
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AAVS1 SparQ All-In-One Inducible Donor Vector (AAVS1-SA-RFP-Puro-EF1-CymR-CuO-MCS-P2A-GFP) |
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0 | |||
[在庫・価格 ：2024年04月28日 00時00分現在]
AAVS1 SparQ All-In-One Inducible Donor Vector (AAVS1-SA-RFP-Puro-EF1-CymR-CuO-MCS)
文献数： 0
- 商品コード：GEQM800A-1
- メーカー：SBI
- 包装：10μg
- 価格：¥295,000
- 在庫：無(未発注)
- 納期：10日程度 ※※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。
- 法規制等：
AAVS1 SparQ All-In-One Inducible Donor Vector (AAVS1-SA-RFP-Puro-EF1-CymR-CuO-MCS-P2A-GFP)
文献数： 0
- 商品コード：GEQM820A-1
- メーカー：SBI
- 包装：10μg
- 価格：¥295,000
- 在庫：無(未発注)
- 納期：10日程度 ※※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。
- 法規制等：
All-in-one Cas9 SmartNuclease AAVS1 Targeting Plasmid
[在庫・価格 ：2024年04月28日 00時00分現在]
| 詳細 | 商品名 |
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文献数 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Cas9 SmartNuclease AAVS1-gRNA Targeting vector, EF1a Promoter |
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[在庫・価格 ：2024年04月28日 00時00分現在]
Cas9 SmartNuclease AAVS1-gRNA Targeting vector, EF1a Promoter
文献数： 0
- 商品コード：CAS601A-1
- メーカー：SBI
- 包装：10μg
- 価格：¥218,000
- 在庫：無(未発注)
- 納期：10日程度 ※※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。
- 法規制等：
| 説明文 | |||
|---|---|---|---|
| 法規制等 | |||
| 保存条件 | -20℃ | 法規備考 | |
| 掲載カタログ |
ニュース2022年9月15日号 p.21 ニュース2021年6月15日号 p.11
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| 製品記事 |
PrecisionX Cas9 SmartNuclease All-in-one Vectors PrecisionX Cas9 SmartNuclease System |
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5' and 3' Primer Mixes for Junction PCR Assays
[在庫・価格 ：2024年04月28日 00時00分現在]
[在庫・価格 ：2024年04月28日 00時00分現在]
5' and 3' Primer Mixes for Junction PCR Assays for #GEQM-8xx (AAVS1 SparQ All-In-One Inducible System, 10μM)
文献数： 0
- 商品コード：GEQM840PR-1
- メーカー：SBI
- 包装：100μl
- 価格：¥52,000
- 在庫：無(未発注)
- 納期：10日程度 ※※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。
- 法規制等：
Cumate Solution
[在庫・価格 ：2024年04月28日 00時00分現在]
| 詳細 | 商品名 |
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Cumate Solution, 1000× |
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[在庫・価格 ：2024年04月28日 00時00分現在]
Cumate Solution, 1000×
文献数： 0
- 商品コード：QM100A-1
- メーカー：SBI
- 包装：500μl
- 価格：¥23,000
- 在庫：無(未発注)
- 納期：10日程度 ※※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。
- 法規制等：
| 説明文 | |||
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| 法規制等 | |||
| 保存条件 | 4℃ | 法規備考 | |
| 掲載カタログ |
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| 製品記事 |
SparQ Cumate Switch Inducible System レンチウイルスベクター関連製品 System Biosciences社特集 |
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追加しました。
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