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[CRISPR-Cas9] guide RNAによる新技術のゲノム編集ツール PrecisionX Cas9 SmartNuclease System

掲載日情報:2015/09/08 現在Webページ番号:7686

guide RNAによる新技術のゲノム編集ツール CRISPR-Cas9特集

CRISPR-Cas9システムは,ゲノム中で切断したい領域を切断できる遺伝子改変ツール(ゲノム編集ツール)です。
切断したい標的塩基配列を含むguide RNA (crRNA:tracrRNA) とCas9タンパク質により,ゲノム上の任意の配列を切断します。標的配列のデザインの簡便さや実験手法の容易さから,CRISPRはZFN(Zinc Finger Nuclease)やTALEN(Transcription Activator-Like Effector Nuclease)と並び,注目されるゲノム編集(genome editing)技術です。

操作法概略

切断したいDNA配列に対する相補的な配列を含むguide RNA,およびその相補鎖を設計し,それらの断片をCRISPRベクターにクローニングします。作成したCRISPR-Cas9発現プラスミドを目的細胞へトランスフェクションすると,CRISPR-Cas9システムにより標的領域が切断されます。

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特長

  • guide RNA (crRNA:tracrRNA)およびCas9タンパク質は1つのCRISPRベクターから発現できるため,細胞への導入が必要となるCRISPRベクターは1種類のみです。
  • CRISPRベクターは線状化されているため,ライゲーションが容易に行えます。
  • プロモーターの異なる3種類のCRISPRベクターがあります。
  • 10反応分の量が含まれています。

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発現プラスミドのベクターマップ

ゲノム編集ツール「CRISPR-Cas9システム」発現プラスミドのベクターマップ

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配列のデザイン方法

標的配列は,末端に「GG」が配置されている領域を選択していただき,NGGの上流20塩基で設計します。切断したい標的配列を含むgRNAおよびその相補鎖をオリゴ合成等で作成していただきます。

標的領域 5’ NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG 3’
デザインする配列 5’ATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3’
        3’NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA 5’

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適用例

CRISPR-Cas9システムでの切断後,ゲノムの切断された部分では,塩基の置換や欠損が誘引され,これにより遺伝子のノックアウトができます。また,切断した部位に特定の配列をノックインしたい場合には,その目的配列を含むドナーベクターを一緒にトランスフェクションすると,相同組換えによりその断片をノックインすることができます。

  • 遺伝子のノックイン,ノックアウトへの利用
  • ゲノム中の任意の位置の改変

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キット内容

  • Lenearized Cas9 Smart Nuclease vector
  • Ligation buffer
  • Fast ligase
  • Fwd Sequecing primer

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関連文献

  1. Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraffini LA, Zhang F. “Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science, 2013 Feb 15 ;339(6121):819-23. doi: 10.1126/science.1231143. Epub 2013 Jan 3.
  2. Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarlo JE, Norville JE, Church GM. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science, 2013 Feb 15; 339(6121):823-6. doi: 10.1126/science.1232033. Epub 2013 Jan 3.

MEMO

CRISPR-Cas9とは


The recent discovery of the type II prokaryotic CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) system, originally discovered in the bacterium Streptococcus pyogenes that works as a mechanism to defend against viruses and foreign DNA, has provided%; a revolutionary tool for targeted genome engineering with simple elegance. The system uses a nuclease, CRISPR-associated (Cas9), that complexes with small RNAs as guides (gRNAs) to cleave DNA in a sequence-specific manner upstream of the protospacer adaptor motif (PAM) in any genomic location. The CRISPR-Cas9 system is comprised of separate guide RNAs known as the crRNA and tracrRNA. These two separate RNAs have been combined into a single RNA to enable site-specific mammalian genome cutting through the design of a short guide RNA. SBI has built a series of all-in-one CRISPR-Cas9 cloning vectors with different promoter options. These cloning vectors will express a human codon-optimized Cas9 nuclease as well as any gRNA sequence of your choice linked to the tracrRNA. Simply design the gRNA for the genome target DNA sequence and clone into the Cas9 SmartNuclease vector for efficient genome engineering.

[CRISPR-Cas9] guide RNA による新技術のゲノム編集ツールPrecisionX Cas9 SmartNuclease System

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使用例

[CRISPR-Cas9] guide RNA による新技術のゲノム編集ツールPrecisionX Cas9 SmartNuclease System

Luciferase切断用CRISPRベクターを用いてLuciferase発現293細胞におけるLuciferaseを切断した解析例 CRISPR-Cas9システムを用いてLuciferase切断を標的とするguide RNAを組み込んだCRISPRベクターを作成し,Luciferase発現細胞にトランスフェクションし,切断効果を検証した。Guide RNAは標的配列の異なる2種類’(gRNA1およびgRNA2)を作成した。
A) Luciferase活性測定による検証。Negative controlに対して,gRNA1およびgRNA2ではLuciferase遺伝子の破壊による活性の低下が見られた。
B)Surveyor Assayを行ったところ,gRNA1およびgRNA2においてそれぞれ30%および22%の切断効果が見られた。

[CRISPR-Cas9] guide RNA による新技術のゲノム編集ツールPrecisionX Cas9 SmartNuclease System

Luciferase切断用CRISPRベクターおよびRFPドナーベクターを用いてRFP遺伝子をノックインした解析例
gRNA1およびgRNA2のどちらにおいても切断部分にRFPドナーベクターが組み込まれた。

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価格

[在庫・価格 :2018年04月24日 19時51分現在]

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EF1-T7-hspCas9-H1-gRNA linearized SmartNuclease vector(10tests)
CAS700A-1 SBIシステムバイオサイエンス
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1 kit ¥131,000
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EF1-T7-hspCas9-H1-gRNA linearized SmartNuclease vector(10tests)

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  • 商品コード:CAS700A-1
  • メーカー:SBI
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Cas9 SmartNuclease AAVS1 Positive Control Kit
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Cas9 SmartNuclease AAVS1 Positive Control Kit

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  • 商品コード:CAS601A-1
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切断部位におけるHomologous Recombinationを行うためのドナーベクターが作製できます。

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piggyBac HR Vector (5'MCS-EF1-GFP-Puro-TK-3'MCS)
PBHR100A-1 SBIシステムバイオサイエンス
System Biosciences, LLC
10 μg ¥212,000
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説明文 切断部位におけるHomologous Recombinationを行うためのドナーベクターが作製できます。EZ-TAL TALE Assembly KitまたはPrecisionX Cas9 SmartNuclease Systemと組み合わせて使用することにより,ゲノム内に変異の修正や変異の導入を行なうことができる。一旦ゲノムに組み込んだセレクション用のマーカー遺伝子は,PiggyBac Transposaseにより痕跡を残さず除去することが可能。 ※営利団体・企業(Commercial Entity)にご所属のお客様が9ヶ月を越えて本製品を使用される場合,ライセンス契約が必要です。
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説明文 切断部位におけるHomologous Recombinationを行うためのドナーベクターが作製できます。
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説明文 切断部位におけるHomologous Recombinationを行うためのドナーベクターが作製できます。
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10 μg ¥161,000
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10 μg ¥212,000
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説明文 切断部位におけるHomologous Recombinationを行うためのドナーベクターが作製できます。EZ-TAL TALE Assembly KitまたはPrecisionX Cas9 SmartNuclease Systemと組み合わせて使用することにより,ゲノム内に変異の修正や変異の導入を行なうことができる。一旦ゲノムに組み込んだセレクション用のマーカー遺伝子は,PiggyBac Transposaseにより痕跡を残さず除去することが可能。 ※営利団体・企業(Commercial Entity)にご所属のお客様が9ヶ月を越えて本製品を使用される場合,ライセンス契約が必要です。
法規制等
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piggyBac HR Vector (5'MCS-EF1-GFP-Puro-TK-3'MCS)

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  • 商品コード:PBHR100A-1
  • メーカー:SBI
  • 包装:10μg
  • 価格: ¥212,000
  • 在庫:無(未発注)
  • 納期:1週間程度

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法規制等
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  • 商品コード:HR100PA-1
  • メーカー:SBI
  • 包装:10μg
  • 価格: ¥147,000
  • 在庫:無(未発注)
  • 納期:1週間程度

説明文 切断部位におけるHomologous Recombinationを行うためのドナーベクターが作製できます。
法規制等
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  • 商品コード:HR110PA-1
  • メーカー:SBI
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  • 価格: ¥161,000
  • 在庫:無(未発注)
  • 納期:1週間程度

説明文 切断部位におけるHomologous Recombinationを行うためのドナーベクターが作製できます。
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  • メーカー:SBI
  • 包装:10μg
  • 価格: ¥161,000
  • 在庫:無(未発注)
  • 納期:1週間程度

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  • 商品コード:HR130PA-1
  • メーカー:SBI
  • 包装:10μg
  • 価格: ¥161,000
  • 在庫:無(未発注)
  • 納期:1週間程度

説明文 切断部位におけるHomologous Recombinationを行うためのドナーベクターが作製できます。
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  • メーカー:SBI
  • 包装:10μg
  • 価格: ¥161,000
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  • メーカー:SBI
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  • 商品コード:PBHR100A-1
  • メーカー:SBI
  • 包装:10μg
  • 価格: ¥212,000
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オリゴ合成受託サービス

「フナコシ オリゴDNA合成受託サービス」のCRISPR-Cas9システム用の注文書をご用意いたしました。
注文書に必要事項をご記入の上,受託・特注品業務担当(jutaku@funakoshi.co.jp)へメールに添付してお送りください。

希釈して直ぐにご使用いただけるように,100μM(蒸留水)に調整し,クローニング用途としてOPCグレードをお勧めします。

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コンピテントセル

Giga Competent Cell (DH5α)

System Biosciences社では,CRISPRベクターの形質転換の際に,形質転換効率が高いコンピテントセル(>1×109 CFUs/μg plasmid)を使用することを推奨しております。

形質転換効率が高いコンピテントセルについては,下記製品の取り扱いがございます。

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抗mycタグ抗体

Cas9タンパク質にはmycタグが付加するため,抗mycタグ抗体を使用してCas9タンパク質を検出できます。

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Cas9の検出

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CONTACT

お問い合わせ先(テクニカルサポート 試薬担当)

reagent@funakoshi.co.jp

製品情報は掲載時点のものですが、価格表内の価格については随時最新のものに更新されます。お問い合わせいただくタイミングにより製品情報・価格などは変更されている場合があります。
表示価格に、消費税等は含まれていません。一部価格が予告なく変更される場合がありますので、あらかじめご了承下さい。