生細胞の膜相状態を定量的に観察できる蛍光イメージング試薬 LipiORDER^®（Membrane Lipid Order Imaging Dye）

LipiORDER^®は環境応答性の蛍光色素で、生体膜の相状態（Lipid order）Lo/Ldをイメージングにより定量的に観察することができます。生細胞中でも高い化学的安定性を示し、細胞膜や細胞内膜など各種膜構造の相状態を観察することができます。

※ 本製品は高知大学 教育研究部総合科学系複合領域科学部門 仁子陽輔博士の研究成果をもとにフナコシ株式会社が製品化し、販売しています。
※本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

また、本試薬は脂質膜に対する親和性が高く、細胞の膜構造に濃縮します。この2つの特長により、本試薬は膜内部の極性に応じて蛍光が緑色から赤色に変化します。相状態は脂質のパッキング密度を反映しており、疎らなパッキングであるLdでは極性が高く、密なパッキングであるLoでは極性が低いことが知られており、膜構造の極性を観察することで相状態を定量的に観察することができます（図2上）。実際に、モデルLo相（sphingomyelin/cholesterol; SM/Chol）においては、緑色蛍光（蛍光極大～510 nm）を示すのに対し、モデルLd相（dioleylphosphatidylcholine；DOPC）においては長波長シフトが起こり赤色蛍光（蛍光極大～575 nm）を示します（図2下）。また、SM/CholとDOPCの中間モデルと考えられるDOPC/Cholでは、SM/CholとDOPCの中間の蛍光スペクトルが観察されることから、本試薬で得られる緑色蛍光強度FG（蛍光顕微鏡での検出波長域の目安500～550 nm）と赤色蛍光強度FR（検出波長域の目安550～650 nm）の蛍光強度比FR/FGを観察することで膜相状態を相対定量することができます。

COS7細胞にLipiORDER^®（300 nM in HBSS）を添加し10分培養後、共焦点レーザー顕微鏡で2波長の蛍光画像（励起光：405 nm、蛍光Green：470～550 nm, Red：550 nm～）を取得した。緑色蛍光画像および赤色蛍光画像をImageJによりレシオメトリック解析（蛍光比F_R/F_G）し、相状態を疑似カラー（Lo■■■■■■■Ld）で可視化した。細胞膜は蛍光強度比が小さく、ERなどの細胞内膜で蛍光強度比が高く見積もられた。

E17.5マウス由来の海馬初代神経細胞（DIV3またはDIV12）にLipiORDER^®（300 nM in HBSS）を添加し、10分間培養後、共焦点レーザー顕微鏡で2波長の蛍光画像（励起光：405 nm、蛍光Green：470～550 nm, Red：550 nm～）を取得した。緑色蛍光画像および赤色蛍光画像をImageJによりレシオメトリック解析（蛍光比F_R/F_G）し、相状態を疑似カラー（Lo■■■■■■■Ld）で可視化した。レシオメトリック解析によりいずれの膜構造においても、細胞膜で蛍光比は小さくLoに近い環境、内膜構造で蛍光比が大きくLdに近い環境が観察された。

レシオメトリック解析像は共焦点レーザー顕微鏡405 nm励起光における緑色蛍光像（470～550 nm）および赤色蛍光像（550 nm以上）を用いてImageJで算出した。

レシオメトリック解析像の疑似カラーヒートマップを段階的に切り分けて表示したところ、蛍光比の低い（Loに近い）シグナルは細胞膜から、蛍光比の大きくなる（Ldに近づく）につれ細胞膜からの距離が離れていることが分かる。

※上記の細胞染色データは名古屋市立大学大学院 薬学研究科 服部光治教授よりご提供頂きました。