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無蛍光性の新規SHGイメージング用色素 Ap3, SHG Imaging Dye

掲載日情報:2019/01/24 現在Webページ番号:63118

フナコシ /
フナコシ株式会社

Ap3は,SHGシグナルイメージングにおいて障害となる蛍光を発しない,初の無蛍光性SHG色素です。

本製品は,慶應義塾大学医学部 薬理学教室,並びに筑波大学数理物質系(学際物質科学研究センター)の研究成果を元に製品化されました。
Nuriya M., et al, Nat. Commun., 7:11557 (2016).
慶應義塾大学医学部 薬理学教室 塗谷先生のインタビュー記事についてはこちらをご覧下さい。



SHG専用色素を用いた細胞膜現象のイメージング
2光子現象の一つである光第二高調波発生(Second Harmonic Generation: SHG)
を利用した顕微鏡による細胞膜の形態および変化の計測


慶應義塾大学 医学部薬理学教室 塗谷 睦生 先生
塗谷先生グループのHPはこちら

【背景】

細胞膜は細胞の内外を隔て,その近傍で起こる電気・化学情報伝達の場となることで細胞間・細胞内情報伝達に非常に重要な役割を果たす。しかし,その繊細さや構造の複雑さなどから,生理学的な解析が困難であった。ここで,細胞膜に親和性の高い色素は細胞膜において強いSHGシグナルを発し,これが膜電位に応じて変化することから,SHGイメージングは細胞膜のラベリングとその電位変化の解析などに非常に有効であると考えられる。

【無蛍光性SHG専用色素Ap3】

Ap3は,新たにSHGイメージングのために開発・合成された無蛍光性SHG専用色素であり,これを用いることにより他の蛍光色素の同時観察も可能となった。これを利用し,神経活動に応じた膜電位の変化をAp3のSHGにより観測し,同時に膜近傍でのカルシウム濃度変化をカルシウム感受性色素の蛍光イメージングにより観測することも可能となった。Ap3を用いたイメージングは,光照射に応じて通常起こるシグナルの減弱や細胞への毒性が非常に低いことも明らかとなっている。よって,Ap3を用いることで細胞膜を可視化し膜電位変化を捉え,同時に蛍光タンパク質の挙動やレポーター蛍光色素のシグナル変化を長期にわたってイメージングすることが可能になると考えられる。これにより,脳細胞のみならず筋細胞を含む他の興奮性細胞の生理学解析,或いは種々の系を用いたイオンチャネルの機能解析などの発展が期待される。

【展望】

また,SHGイメージングは上記以外にも細胞膜のダメージや脂質組成,更には核酸やタンパク質といった生体分子の構造変化など,幅広い生命現象を高感度で検出できることも知られている。SHGイメージングはこのような特殊な能力を持ちながら通常の多光子顕微鏡システムを利用することで容易に遂行可能なものであり,専用色素により応用性が広がることで,SHGイメージングがライフサイエンス分野の研究の新たなツールとして更に展開して行くものと期待される。

特長

  • Ap3はSHGイメージング専用の色素です。SHGシグナル以外,蛍光を発しません。
  • Ap3は無蛍光性であるため,SHGイメージングと同時に,カルシウムイメージング等の蛍光性イメージングとのマルチモダル・イメージングが可能です。
  • Ap3は極めて光安定性が高い化合物です。
  • Ap3は光毒性が非常に小さく,細胞へのダメージが最小限です。

SHGイメージングには,2光子励起顕微鏡と,SHGシグナル用のフィルター(例:465-485 nmのバンドパスフィルター)が必要です。
SHGシグナルの観察には,対物レンズの反対側(正立顕微鏡の場合は下部)に検出系が必要です。また,検出系側に光電子増倍管(PMT)がある顕微鏡の使用を推奨します。

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操作方法概略

  1. ガラスボトムディッシュで細胞を培養する。
  2. 20μM Ap3溶液を細胞へ添加する。
  3. 2光子励起顕微鏡で観察する。

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使用例1

Ap3のSHGシグナルと無蛍光性

Ap3のSHGシグナルと無蛍光性
Ap3によりSHGシグナルは観察されるが,蛍光シグナルは観察されない。



脳スライスでのSHGイメージングによる膜電位変化

脳スライスでのSHGイメージングによる膜電位変化
a: 電圧固定によるSHGシグナルの膜電位感受性。
b: 活動電位に依存したSHGシグナル変化(左)とパッチクランプによる電位変化の計測。
Nuriya M., et al, Nat. Commun., 7:11557 (2016).



脳スライスでのSHGイメージングによる膜電位変化とRhod-2-TPFによるカルシウム濃度の同時計測

脳スライスでのSHGイメージングによる膜電位変化とRhod-2-TPFによるカルシウム濃度の同時計測
膜電位変化とカルシウム濃度変化が同時に計測される。
Nuriya M., et al, Nat. Commun., 7:11557 (2016).


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使用例2

マルチモダル2光子顕微鏡を用いた形質膜選択的SHGイメージングと細胞膜一般GFPイメージングの比較

マルチモダル2光子顕微鏡を用いた形質膜選択的SHGイメージングと細胞膜一般GFPイメージングの比較
細胞膜観測用のmembrane-anchored GFPを発現する細胞をAp3で染色し,フェムト秒レーザー照射に応じたGFPの2光子蛍光(TPF, 緑)とAp3のSHG(マゼンタ)シグナルを同時に可視化した。
GFPシグナルが形質膜のみならず,小胞など多くの細胞内の膜構造から強いシグナルが出ているため形質膜位置の正確な同定が困難なのに対し,Ap3-SHGシグナルは形質膜のみから発生し,形質膜の選択的イメージング,部位の正確な同定が可能となる。
Mizuguchi T., et al, iScience., Nov 30 ; 9 :359~366 (2018).



マルチモダル2光子顕微鏡を用いた形質膜直下の小胞動態とアクチンの解析

マルチモダル2光子顕微鏡を用いた 形質膜直下の小胞動態とアクチンの解析
アクチン観測用にGFPタグアクチンを発現する細胞において,エンドサイトーシス後の小胞を10kDa-Dextran Alexa 594で,形質膜をAp3でそれぞれ染色し,これらをマルチモダル2光子顕微鏡により同時に可視化した。
形質膜特異的でありかつ蛍光シグナルと完全に分離可能なAp3-SHGによる形質膜位置の正確な同定から,形質膜からアクチン骨格までの正確な距離の計測が可能となる。
Mizuguchi T., et al, iScience., Nov 30 ; 9 :359~366 (2018).




マルチモダル2光子顕微鏡を用いた形質膜直下の小胞動態とチューブリンの解析

マルチモダル2光子顕微鏡を用いた形質膜直下の小胞動態とチューブリンの解析
Tubulin Trackerで微小管を染色した細胞において,エンドサイトーシス後の小胞を10kDa-Dextran Alexa 594で,形質膜をAp3でそれぞれ染色し,これらをマルチモダル2光子顕微鏡により同時に可視化した。
形質膜特異的でありかつ蛍光シグナルと完全に分離可能なAp3-SHGによる形質膜位置の正確な同定から,形質膜から微小管、また、形質膜の直下で動く小胞までの正確な距離の計測が可能となる。
Mizuguchi T., et al, iScience., Nov 30 ; 9 :359~366 (2018).


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価格

[在庫・価格 :2019年06月24日 23時07分現在]

※ 納期として表示している期間は弊社発注日からの「目安」となり、納期を保証する物ではございません。実際には長くかかる場合もございます。ご注意ください。
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Ap3, SHG Imaging Dye
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SHGイメージング専用の色素。必要装置:二光子励起顕微鏡, SHGシグナル用フィルター。※SHGシグナルの観察には,対物レンズの反対側(正立顕微鏡の場合は下部)に検出系がある必要があります。また,検出器側に光電子倍増管(PMT)がある事が望まれます。
法規制等
保存条件 -20℃ 法規備考
掲載カタログ ニュース2019年3月15日号 p.20

製品記事
関連記事 【研究室でインタビュー】
慶應義塾大学 医学部 薬理学教室

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Ap3, SHG Imaging Dye

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  • 商品コード:FDV-0008
  • メーカー:FNA
  • 包装:1mg
  • 価格:¥40,000
  • 在庫:3個以上
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  • 法規制等:

説明文 SHGイメージング専用の色素。必要装置:二光子励起顕微鏡, SHGシグナル用フィルター。※SHGシグナルの観察には,対物レンズの反対側(正立顕微鏡の場合は下部)に検出系がある必要があります。また,検出器側に光電子倍増管(PMT)がある事が望まれます。
法規制等
保存条件 -20℃ 法規備考
掲載カタログ ニュース2019年3月15日号 p.20

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慶應義塾大学 医学部 薬理学教室



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(テクニカルサポート 試薬担当)

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