VitroGel High Concentrationシリーズの適用例（TheWell Bioscience社） ヒト大腸がん細胞（HCT116）の三次元（3D）細胞培養

VitroGel High Concentrationシリーズの適用例として、ヒト大腸がん細胞（HCT116）の三次元細胞培養モデル（創薬アプリケーション）をご紹介します。
VitroGel 3D（浮遊細胞に最適な標準ハイドロゲル）とVitroGel 3D-RGD（接着細胞に適したRGDペプチド修飾ハイドロゲル）を使用して二次元（2D）培養用プレートへのコーティング、三次元（3D）細胞培養、および薬物試験を行い、HCT116細胞の生存率を評価しました。
VitroGelシステムは、HCT116細胞を大腸がんモデルとして用いた医薬品開発研究の実行可能な手法として立証されています。

※ 詳細は、VitroGel High Concentrationシリーズをご覧下さい。
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※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

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VitroGel 3D（V-3D）とVitroGel 3D-RGD（V-REG）を使用し、播種してから24時間後（Day 1）および7日後（Day 7）のHCT116細胞を評価した。
細胞を播種する前にVitroGelハイドロゲルを固定化する二次元コーティング法を用いると、VitroGelシステムの種類に応じて細胞は異なる形態を示した。VitroGel 3Dでは、細胞は24時間後にスフェロイドを形成し、7日後までサイズが大きくなり続けた。標準的なVitroGel 3Dと同様に、VitroGel 3D-RGD上の細胞も24時間後にスフェロイド細胞群を形成し始めた。しかしVitroGel 3Dハイドロゲルとは異なり、細胞は7日後に広がり、標準的な処理済みプラスチック培養用プレートでの二次元培養を連想させる形態を示した。VitroGel 3D-RGDシステムでゲルの固定化前に細胞をハイドロゲルに播種する三次元細胞培養法を用いると、HCT116細胞はハイドロゲル内を均一に分布することが分かる。この過程はゆっくりと始まり、24時間後の細胞群は非常に小さく（1つの集団あたり2～3個の細胞のみ）なっている。7日目までに集団はより小さくなり、より均一なサイズのスフェロイドに成長した。

左図－1：0希釈（主にハイドロゲル）、中央図－1：1希釈（ハイドロゲル／PBS）、右図－1：2希釈

ハイドロゲル強度はその機械的特性、ひいてはハイドロゲル内の細胞生存率および細胞応答に影響を与える可能性がある。VitroGel 3D-RGD（V-REG）について、3種類の異なるハイドロゲル強度（濃度）におけるHCT116細胞の成長性および生存率を解析した。
7日後、1：1希釈では大きなコロニーが認められたが、他の希釈率では異常な形態の小さな細胞群／コロニーのみであった。Live/Deadアッセイにより細胞生存率を解析したが、コロニーのサイズは小さくなったにもかかわらず、どの希釈率でも有意な細胞死は見られなかった。
1：0および1：2希釈の細胞は、多くのDeadマーカーを提示してはいないが、その形態は死にかけている可能性があることを示唆している。
1：1希釈ではより多くの細胞が存在し、一般に細胞の健康状態の悪化と関連する平坦な形態はとるものの、足場（scaffold）で可能な増強された細胞－マトリックス間の相互作用が、二次元細胞培養で使用される超低接着プレートで見られるスフェロイドの形態を抑えたと考えられる。
この形態は、in vivo環境を模倣するのに適した良好な細胞－マトリックス間相互作用を示している可能性があり、最適な足場（scaffold）の希釈率は1：1（ハイドロゲル／PBS）であることも示唆している。

5-fluorouracil（5-FU）は、大腸がんを含む数種類のがんの治療で使用される一般的な抗がん物質。結腸がんである程度の成功を示した人もいたが、最近のいくつかの研究では多くの患者が5-FUに対する耐性を生じることが指摘されており、他の研究では5-FUはミスマッチ修復遺伝子変異を有する結腸がんの小さなサブセットにのみ作用することが分かっている。
三次元細胞培養システムと並列した従来の二次元細胞培養システムを用いたHCT116細胞での5-FU試験では、5-FUのわずかな効果が示された。
二次元細胞培養では、薬物濃度が10μMから50μMに増加すると薬効が高まることが分かる。しかし三次元細胞培養システムでは、どの段階でも有意な薬物効果はなかった。50μMの場合でのみ顕著な効果があり、細胞コロニーのサイズが小さくなっていることがはっきりと観察できる。
Live/Deadアッセイによる細胞死の定量化により、二次元細胞培養での死細胞レベルの増加が示された。これは、がん細胞の死滅における5-FUの有効性を示唆している。しかし三次元細胞培養では、どの段階でも有意なレベルの死細胞は見られなかった。50 μMまでほとんど存在しない。
生細胞の定量化は、薬物濃度の増加につれて着実な減少を示した。しかし三次元細胞培養では、この減少は見られなかった。
5-FUを添加したHTC116細胞のVitroGel培養では、有意な反応は示されなかった。
※ 0.05未満のp値は有意（*）、0.005未満のp値は非常に統計的に有意（**）、0.001未満の値は極めて統計的に有意（***）と見なす。

Dilution Solutionは、培地を混合する前にVitroGelを希釈する際に使用するReady-to-useの別売り品です。VitroGel 3D High ConcentrationおよびVitroGel RGD High Concentrationには1本添付されますので、ご注文の際に、TYPE 1かTYPE 2（各50 ml）のいずれかをご選択下さい。VitroGel Organoid Recovery Solutionは、VitroGelまたは動物由来の細胞外マトリックス（ECM）で培養したオルガノイドや三次元培養細胞を、酵素を使用せずに迅速かつ効率的に回収できる溶液（別売）です。商品コードをクリックすると各製品の価格表をご覧いただけます。

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