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VitroGelシステムを用いたラット不死化神経芽細胞の三次元/二次元(3D/2D)培養 VitroGelと他社ハイドロゲルの比較例(TheWell Bioscience社)

掲載日情報:2021/07/29 現在Webページ番号:70070

VitroGel 3D High Concentrationシリーズの適用例として、ラットB35不死化神経芽細胞の形態、自己組織化、および生存について他社製品と比較した例をご紹介します。
ラットB35神経芽不死化細胞(ATCC® CRL-2754™)を無血清のVitroGel 3D High Concentration(#TWG001、浮遊細胞に最適な標準ハイドロゲル)、VitroGel RGD High Concentration(#TWG003、接着細胞に適したRGDペプチド修飾ハイドロゲル)および他社ハイドロゲルを厚くコーティングしたプレート表面に播種し、二次元(2D)(浅層三次元(3D)カプセル化)培養を実施しました。

ハイドロゲルコートプレートを用いた3D培養の利点

ハイドロゲルをコーティングした(厚めの2D/浅めの3D)プレート表面への細胞の播種は、完全な3D培養と従来の2D培養の間の妥協点として魅力的です。この方法によって、細胞が硬い表面に曝されるのを防止し、細胞の生存と成熟を促進すると同時に、高度な再現性と拡張性を維持できます。これらの利点は、より壊れやすく組織ニッチを必要とする神経培養にとって特に有益です。神経細胞の場合、通常は適切な神経機能と成熟を再現するために、より複雑でかつ厳しい制御が必要となります

Lu, HF., et al., "Efficient neuronal differentiation and maturation of human pluripotent stem cells encapsulated in 3D microfibrous scaffolds.", Biomaterials., 33 (36), 9179~9187 (2012). [PMID:22998816]



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比較例

方法

ニューロンの非分化での維持

ラットB35不死化神経芽細胞(ATCC® CRL-2754™)をin vitroで長期間のニューロンの成熟と生存モデルとして使用した。B35細胞は、10%FBSおよびpen/strep添加DMEM培地中で活発に分裂して非分化状態を維持し、必要に応じて1週間に2度の頻度で全培地交換を行った。細胞が80%コンフルエントに達したらトリプシン-EDTAを加えて室温で5分間インキュベーションし、1:10の比率で継代を行った。平均して、前述の方法で維持した培養物は、4日ごとに継代し、分裂能や無血清時の成熟状態の劣化を伴うことなく20継代以上増殖させることができた。

厚くハイドロゲルをコーティングした2D(浅層3D)培養でのニューロンの分化と生育

未分化のB35ラット神経芽不死化細胞(ATCC® CRL-2754™)を、ATCC®のガイドラインに従って無血清DMEM培地を用い、VitroGel 3D High Concentration(#TWG001)または他社ハイドロゲルをプレート表面に厚くコーティングした2D(浅層3D)上に播種、培養し分化させた。B35細胞は、無血清DMEM培地に維持すると約5日で有糸分裂してシナプスが活性化する。VitroGel 3D High Concentration(#TWG001、ハイドロゲル:DMEM=4:1)または他社品(80%ハイドロゲル、20%DMEM)を37℃で20分間ゲル化後、B35分化培地(DMEM+pen/strep)で最大21日間灌流した。

in vitroにおける21日間以上の浅層3D組織培養の特性評価

ハイドロゲル上に播種後すぐにFBSを取り除き、分化を誘導させた。週に2回、完全無血清培地に交換しながら、3週間に渡り細胞を培養した。

神経細胞の免疫細胞化学分析

培養状態、形態、および生存評価のため、細胞を3日目、7日目、9日目、および21日目に固定し、ニューロン特異的マーカーである抗β-Ⅲ-Tubulin抗体(T5076; Sigma-Aldrich社)およびAlexa Fluor 647標識ロバ抗マウスIgG抗体(ThermoFisher社)で染色して観察した。核はDAPI(ThermoFisher社)で対比染色した。

結果

分化後3日目で細胞は広がり、神経様ネットワークの形成が見られた。7~9日目には細胞の生存、培養の広がり具合や形態解析において、VitroGel 3D High Concentration(#TWG001)と他社ハイドロゲルは同等の効果が見られた。

他社ハイドロゲルをコーティングした場合、9日目から細胞培養の健全性と生存率が急激に低下し、14日目までにほとんどの細胞が剥離し、神経突起が収縮し、21日目までには細胞の大部分が消失した。一方、VitroGel 3D High Concentration(#TWG001)をコーティングした場合では、分化したB35ニューロンは、2D/3D細胞培養の2週間を含め、非常に早い段階(7日目)に自己組織化し3Dクラスター化する傾向が見られた。その後21日目まで、細胞は自己組織化3Dクラスターに移動し、厚層ハイドロゲルマトリックスに埋め込まれた。クラスター間には細胞はほとんど存在しないものの、有意な細胞死は見られなかった(下図参照)。

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2D(厚層ハイドロゲル)/薄層3D+無血清培地上でのB35細胞の長期培養

ラットB35神経芽細胞の長期培養におけるハイドロゲルの違いの影響

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図1. ラットB35神経芽細胞の長期培養におけるハイドロゲルの違いの影響

B35細胞は、細胞骨格マーカーである抗β-Ⅲ-チューブリン抗体(緑色)を用いて染色した。核はDAPI(青色)で対比染色した。

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2D(薄層ハイドロゲル)でのB35細胞の分化と維持

B35ニューロンは、2D(厚層)ハイドロゲルコーティング法のほか、2D薄層ハイドロゲル法でも分化および維持が可能です。組織培養処理プレートを、DMEM培地と混合したVitroGel RGD High Concentration(#TWG003、1:20希釈)または他社ハイドロゲル(DMEMストック溶液から1:100希釈(約80~120μg/ml))でそれぞれ室温で2時間コーティングした。

2週間に渡り細胞の表面への接着性を追跡すると、VitroGel RGD High Concentration-RGD(#TWG003)上に播種した細胞は接着性が良好で、FBS除去後は典型的な神経形態の広がりが見られ、B35系統では、後有糸分裂期のニューロンへの分化が起こった。一方、他社ハイドロゲルを用いて同じ期間で対照実験を実施した(図2参照)。それぞれのハイドロゲル上における細胞の接着性は良好であり、培養物の分化や神経突起伸長も両方で観察された。VitroGel RGD High Concentration-RGD(#TWG003)は異種由来成分不含で、化学的に定義された表面コーティングを行うことができることから、培養条件の制御の強化や複雑な実験における交絡因子を低減することができる。

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図2. 2D薄層ハイドロゲルコーティングに播種し長期培養したB35細胞の比較

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使用製品

VitroGel 3D High Concentration

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VitroGel 3D High Concentration(#TWG001

VitroGel RGD High Concentration

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VitroGel RGD High Concentration(#TWG003

VitroGelシステムとは

TheWell Bioscience社のVitroGelシステムは、すぐに使用できる調製可能なハイドロゲルシステムです。2Dおよび3Dシステムの両方で用いることができ、in vitroおよびin vivoの両アプリケーションで使用可能です。ハイドロゲルはVitroGel濃度や細胞密度に基づいて調製可能であり、また細胞のタイプに合わせて調製し、任意の培地と混合して足場(scaffold)を生成できます。VitroGelシステムは、様々な用途向けに多様な細胞型の3D構造の構築に使用されています。
例えば、新しい抗がんペプチドの有効性を解析した最近の研究では、乳がん細胞が培養中の他の細胞とスフェロイド群を形成することが分かりました。この新規ペプチドの添加はスフェロイドの崩壊をもたらし、このことは二次元環境下では解明されなかった、接着に依存しない細胞増殖を阻害できる可能性を示唆しています。
こちらからVitroGel 3D High Concentrationシリーズ製品の詳細をご覧いただけます。

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Rat B35 Neuroblastoma

ATCCロゴ

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品名 包装 ATCC® No.
Rat B35 Neuroblastoma 1 ml CRL-2754™


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価格

VitroGel 3D High Concentration

[在庫・価格 :2024年03月29日 20時15分現在]

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納期 文献数
VitroGel 3D High Concentration & Dilution Solution TYPE1
10日程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 50
説明文
使用前に希釈することで,ゲル強度の調節が可能なタイプのハイドロゲル。修飾:なし。TYPE I Dilution Solution付属(スクロース含有,50 ml)。
法規制等
保存条件 室温,4℃ 法規備考
掲載カタログ ニュース2023年3月1日号 p.12
ニュース2022年3月15日号 p.7

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10日程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 50
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使用前に希釈することで,ゲル強度の調節が可能なタイプのハイドロゲル。修飾:なし。TYPE II Dilution Solution付属(スクロース非含有,50 ml)。
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VitroGel RGD High Concentration

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VitroGel RGD High Concentration & Dilution Solution TYPE1

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VitroGel RGD High Concentration & Dilution Solution TYPE2

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お問い合わせ先

(テクニカルサポート 試薬担当)

reagent@funakoshi.co.jp

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