生細胞の脂肪酸代謝過程を3色で可視化 LipiDye^®-M ＜Lipid Metabolism Tracer＞

LipiDye^®-Mは環境応答性蛍光色素で標識された蛍光標識脂肪酸で，脂質の代謝状態とその周辺環境によって蛍光色が大きく変わるため，脂肪酸の代謝過程を緑色・黄色・赤色蛍光で追跡することができます。脂質代謝の基礎研究や脂質代謝を標的にした創薬研究に有用です。
※ 本製品は名古屋大学 トランスフォーマティブ生命分子研究所　山口茂弘教授，多喜正泰特任准教授の研究成果をもとに，フナコシ株式会社が製品化し，販売しています。
※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

LipiDye^®-Mの細胞内脂質代謝過程のイメージ（左）と染色例（右）
LipiDye^®-Mは環境応答性色素標識脂肪酸で，脂肪酸トランスポーターを介して細胞内に取り込まれた後，細胞内で脂質代謝を受け局在が変わるごとに蛍光が変化する特性を有しています。イメージングにより緑色蛍光と赤色蛍光画像を取得し，重ね合わせることで，脂質代謝の状態を3色で染め分けることができます。

LipiDye^®-Mの環境応答性の違いを適切に観察するため，励起波長と蛍光波長は十分に検討が必要です。共焦点レーザー顕微鏡の使用を推奨しています。下記スペクトルを参考に励起光源・検出フィルターをご検討下さい。

LipiDye^®-MのPBS，リン脂質リポソーム，大豆油中の励起・蛍光スペクトル

"A negative-solvatochromic fluorescent probe for visualizing intracellular distributions of fatty acid metabolites."
Kajiwara K., et al., Nat. Commun., 13 (1), 2533 (2022). [PMID:35534485]

3T3-L1細胞から分化させた脂肪細胞に対し，LipiDye^®-M（5 μM）を添加し，添加直後（1分後）および30分後に無洗浄条件下で共焦点レーザー顕微鏡を用いて蛍光観察を行った（Green channel Ex 473 nm / Em 490～540 nm，Red channel Ex 559 nm / Em 570～620 nm）。添加1分後では主に細胞質から緑色のシグナルが強く得られ，脂肪滴由来の赤色シグナルは弱いことから，LipiDye^®-Mは遊離脂肪酸や脂肪酸CoAの状態が多く，脂肪滴にまだ十分に取り込まれていないことを示唆する。一方，30分後では緑色シグナルが減少し，脂肪滴の赤色シグナルが強くなっていることから，LipiDye^®-MはTAGに変換され，脂肪滴に取り込まれていることが示唆される。TAG合成酵素であるDGATの阻害物質で処理すると，30分後において脂肪滴由来の赤色シグナルは顕著に抑制され，小胞体（ER）などのオルガネラ膜由来の黄色シグナルが強く観察された。この結果は，LipiDye^®-MはDAGまで変換されても，TAGには変換されず，ERなどのオルガネラ膜に留まっていることを示唆している。

HepG2細胞の脂肪滴産生を促すためオレイン酸およびパルミチン酸を含む10％ FBS条件下で培養した。培地をHBSSに交換し，飢餓条件下にてLipiDye^®-M（5 μM）で60分間処理した後，無洗浄条件下で共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察を行った（Green channel Ex 473 nm / Em 490～540 nm，Red channel Ex 559 nm / Em 570～620 nm）。飢餓条件下ではLipiDye^®-MはHepG2細胞の細胞質（緑色），ER（黄色），脂肪滴（赤色）に加えミトコンドリア（黄色）からも観察された。LipiDye^®-Mの代謝状態を確認するため，HepG2細胞から生化学的に脂質成分を抽出し，TLCで分離し，LipiDye^®-Mの蛍光を指標に検出した。LipiDye^®-MはHepG2内で様々な脂質に変換されていることを示す複数のスポットが観察され，遊離脂肪酸型LipiDye^®-Mよりも上方（高疎水性）はTAGやコレステロールエステル，下方（低疎水性）はミトコンドリアにおける脂肪酸β酸化（FAO）代謝物とDAG，原点付近はリン脂質と考えられる。

HepG2細胞をあらかじめアシルCoA合成酵素（ACS）阻害物質（Triacsin C）またはTAG合成酵素DGAT1阻害物質（T863）を含む完全培地中で18時間処理し，各代謝経路を阻害した（右図）。その後，脂肪滴産生を促進するためオレイン酸（0.5 mM），各阻害物質およびLipiDye^®-M（5 μM）を含むHBSS培地で飢餓条件下にて6時間処理し，無洗浄条件下で共焦点レーザー顕微鏡（Green channel Ex 473 nm / Em 490～540 nm，Red channel Ex 559nm / Em 570～620 nm）を用いて観察した。コントロールでは脂肪滴の赤色シグナルが強く観察されたのに対し，ACS阻害物質処理細胞では脂肪滴の赤色シグナルおよびオルガネラ膜の黄色シグナルは弱く，緑色シグナルが優位に観察された。また，DGAT1阻害物質処理細胞では脂肪滴由来の赤色シグナルはほとんど見られず，オルガネラ膜の黄色シグナルが顕著に増強していることが観察された。ACS阻害物質によりLipiDye^®-Mは遊離脂肪酸からアシルCoAに変換できず，遊離脂肪酸のまま留まっていることを示している。また，DGAT阻害物質によりDAGからTAGへの変換が阻害され，脂肪滴に移行できずにERなどのオルガネラ膜に蓄積していることを示している。このように，薬剤処理時のLipiDye^®-Mの局在と蛍光色を評価することで，薬剤が脂質代謝のどの過程に関与しているかを評価することができる。

HepG2細胞をオートファジー阻害物質（50 nM Bafilomycin A1；オートファゴソーム‐リソソーム膜融合阻害物質）または脂肪分解阻害物質（100 μM DEUP）およびLipiDye^®-M（5 μM）を含むHBSSで6時間処理した後，LipiDye^®-Mの脂質代謝状態を共焦点レーザー顕微鏡（Green channel Ex 473 nm / Em 490～540 nm，Red channel Ex 559 nm / Em 570～620 nm）で観察し，重ね合わせ画像およびレシオ解析画像を取得した。コントロール条件下では，重ね合わせ解析像においてLipiDye^®-Mはミトコンドリア（緑色）および脂肪滴（赤色）で主に観察されていたが，オートファジー阻害物質処理すると重ね合わせ画像において小胞様構造（オートファゴソーム）の膜が黄色で検出されており，オートファジーによる脂質分解が抑制されていることがわかる。また，脂肪分解阻害物質処理により，重ね合わせ画像において全体的に赤色蛍光が強まっており，LipiDye^®-Mは脂肪滴およびオルガネラ膜に蓄積していることがわかる。また，レシオ解析像および散布図において脂肪分解阻害物質処理時はコントロールおよびオートファジー阻害物質処理時に比べGreen/Red比が大きく減少していることがわかる。
※ 詳しいレシオ解析方法については原著論文をご参照下さい。