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E-カドヘリンを足場材に用いた幹細胞培養プレート E-cadherin Fc プレート

掲載日情報:2021/01/14 現在Webページ番号:65933

細胞培養基質としての利用が困難であったE-cadherinを、配向的にコーティングした幹細胞培養プレートです。
ヒトiPS細胞のソーティング、セレクションと未分化維持培養が一度に可能です。
その他の幹細胞(マウスES細胞, ラットNSC, ヒトMSC)への利用も文献報告があり、単層培養や分化能維持効果が報告されています。

E-cadherin幹細胞培養プレートの外観

E-cadherin(E-カドヘリン)とは

E-cadherinとは(クリックで展開します)

カドヘリンは細胞接着分子の1種で、細胞間接着や形態形成、シグナル伝達などに重要な役割を果たす糖タンパク質です。カドヘリンはカルシウム存在下でシスのホモ二量体を形成し、さらに隣り合う細胞のシス二量体とトランス結合することで細胞間接着に貢献しています。
E-カドヘリンはカルシウムイオンに依存的な接着能を有しており、細胞培養基盤への足場材、培養基質としての応用が期待されています。しかし、E-カドヘリンは膜貫通型タンパク質であり、通常の培養基質の溶液を調整し、細胞培養基盤へコーティングすることは困難でした。

E-cadherin FcプレートはE-cadherinに特殊な加工を施すことで、疎水性表面への配向的なコーティングを可能にしました。E-cadherin Fcコーティングプレート上では、細胞間接着に近い状態が再現され、フィーダーレスでiPS細胞を未分化性を維持したまま増殖させることが可能です。また、増殖に際しては、コンタクトインヒビションが発生するまで、通常の細胞と同様に増え続けることが判っています。


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特長

  • E-cadherin発現細胞が優先的に接着するため、未分化ヒトiPS細胞を優先的に接着、セレクション可能です。
  • 分化してE-cadherinを発現しなくなったヒトiPS細胞は遊離するため、未分化維持培養が可能です。
  • ヒトiPS細胞の完全単層培養(ゆるいコロニーでの培養)が可能です。
  • ヒトiPS細胞のシングルセルでの継代が可能です。
  • ヒトiPS細胞の播種から24時間後にROCK阻害剤を取り除くことが可能です。
  • ヒトiPS細胞はキレート剤による剥離が可能なため、細胞へのダメージを抑えた継代が可能です。
  • 強固なコロニーを形成しにくいため、比較的均一な試薬処理が可能です。
  • Xeno freeで常温保管が可能です。

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文献報告実績 (詳細は文献報告例、参考文献をご覧下さい)

マウスES細胞
  • 未分化維持培養が報告されています。
  • トランスフェクション効率の向上が報告されています。
  • シングルセル培養が報告されています。
  • 従来の足場材よりも増殖活性が高いことが報告されています。
  • 細胞培養時にはLIFの依存性が低くなる事が報告されています。
ラットNSC
  • 2次元培養が報告されています。
  • 未分化維持培養が報告されています。
  • 高効率なアストロサイト分化誘導が報告されています。
ヒトMSC
  • 従来の足場材よりも細胞の増殖活性が高いことが報告されています。
  • 細胞分泌機能が向上することが報告されています。
  • アポトーシスが抑制されることが報告されています。

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原理

E-cadherin Fcを細胞培養基質とすることで、E-cadherinを発現した細胞を優先的に吸着、培養可能です。
例えば、ヒトiPS細胞を本プレートで培養すると未分化iPS細胞のみを優先的に接着、セレクション可能であることがわかっています。また、意図しない細胞分化によって、E-cadherinを発現しなくなったヒトiPS細胞は遊離しやすくなるため、未分化状態を維持したまま培養・回収することができます。

 E-cadherin発現した細胞を優先的に吸着

これまでのiPS細胞培養は基本的にタイトなコロニーでの培養が中心ですが、本培養プレートではヒトiPS細胞の完全単層培養(ゆるいコロニーでの培養)が可能です。
強固なコロニーを形成しにくいため、トランスフェクション、分化誘導、試薬による細胞刺激等の細胞処理をより均一に引き起こすことが可能です。

 E-cadherin発現した細胞を優先的に吸着    E-cadherin発現した細胞を優先的に吸着
試薬が中まで届きにくい試薬が均一に行き渡る


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操作方法概略

■使用方法

    1. 製品を開封後、PBS(+)をwellに添加し、満遍なく行き渡らせて下さい。
    2. アスピレーターでPBS(+)を除去し、細胞を播種して下さい。
      (well表面が乾燥しない様に直ちに細胞を播種して下さい。)

■細胞剥離方法(iPSCの場合)

    1. 培地を除去後、PBS(-)でリンスし、0.5 mM EDTA in PBSを添加して下さい。
    2. 37℃のCO2インキュベーターで2~5分程度インキュベートして下さい。
    3. 通常のiPS細胞剥離方法と同様に、ロックインヒビター入りの培地を添加、ピペッティングで細胞を剥がして下さい。
    4. 遠心して上清を除き、ロックインヒビター入りの培地で再懸濁し、播種します。
      ( ピペッティングにより、播種する細胞がシングルセル状態までバラバラになっても、本製品上で培養が可能です。播種密度の目安は、2.1×104/cm2程度です。)

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使用例:ヒトiPS細胞

ヒトiPS細胞をE-cadherin Fcプレートで培養した。

ヒトiPS細胞の完全単層培養

ヒトiPS細胞を完全単層(ゆるいコロニー)で培養可能であった。

 E-cadherin発現した細胞を優先的に吸着

接着細胞から多能性マーカー(Nanog, Oct4)が観察され、未分化性を維持していることがわかった。

ヒトiPS細胞をE-cadherin Fcプレートで前培養した後、別のプレート上で肝細胞に分化させた。

 E-cadherin発現した細胞を優先的に吸着

肝細胞の特徴である敷石状と双核状が観察された。
E-cadherin Fcプレート上で繰り返し継代したヒトiPS細胞は、従来品で継代した細胞と比較して同等の肝細胞分化能を持っていた。


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文献報告例:マウスES細胞

マウスES細胞の培養例

マウスES細胞をゼラチンコーティングプレートとE-cadherin Fcプレートで培養し、効果を検証した。

 E-cadherin発現した細胞を優先的に吸着

E-cadherin Fcプレートによる培養で未分化マーカー(Oct3/4)が観察されている。
単一細胞レベルで未分化維持・分散が認められた。

 E-cadherin発現した細胞を優先的に吸着

増殖細胞数やBrdUの取り込みから、高い増殖活性を持つことが認められた。

 E-Cadherin発現した細胞を優先的に吸着

GFPをコードしたプラスミドをトランスフェクションした結果、E-cadherin Fcプレートによる培養で遺伝子導入効率の向上が認められた。

 E-cadherin発現した細胞を優先的に吸着

E-cadherin Fcプレートで培養した細胞は、LIFの依存性が低いことが認められた。
LIF使用量を低減でき、大幅なコストダウンが可能であると考えられる。


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文献報告例:ラットNSC(神経幹細胞)

ラットNSCの培養例

ラット神経幹細胞をE-cadherin Fcプレートで培養した。

 E-cadherin発現した細胞を優先的に吸着

ラットNSCの2次元培養が観察された。また、通常プレートで再度培養することにより可逆的に3次元培養引き起こすことが報告されている。

ラット神経幹細胞をE-cadherin Fcプレートで培養した後、アストロサイトへ分化誘導を行った。

 E-cadherin発現した細胞を優先的に吸着  E-cadherin発現した細胞を優先的に吸着

Nestin:NSCマーカー、MAP2:NeuronalマーカーGFAP:アストロサイトマーカー、O2:オリゴデンドロサイトマーカー

 E-cadherin発現した細胞を優先的に吸着

Nestin:NSCマーカー、 NeuN:Neuronalマーカー、GFAP:アストロサイトマーカー、 Olig2:オリゴデンドロサイトマーカー

E-cadherin Fcプレートで培養したNSCは未分化状態が維持され、アストロサイトへの分化を優位に引き起こすことが認められた。


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文献報告例:ヒトMSC(間葉系幹細胞)

ヒトMSCの培養例

ヒト間葉系幹細胞をE-cadherin Fcプレートで培養した。

 E-cadherin発現した細胞を優先的に吸着

EdUの取り込みから、高い増殖活性を持つことが認められた。

 E-cadherin発現した細胞を優先的に吸着

E-cadherin Fcプレートで培養したMSCでは、アポトーシス抑制が観察された。
Caspase-3、LDH:アポトーシスマーカー

 E-cadherin発現した細胞を優先的に吸着

MSCの質を示す分泌系タンパク質の遺伝子発現亢進が認められた。

 E-cadherin発現した細胞を優先的に吸着

E-cadherin Fcプレートで培養したMSCでは、EGFRが活性化され、AKTとERKのリン酸化が確認された。

 E-cadherin発現した細胞を優先的に吸着

 E-cadherin発現した細胞を優先的に吸着

E-cadherin Fcプレートで培養したMSCでは、βカテニンの発現が亢進し、βカテニンの核移行が認められた。



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それぞれの画像をクリックすると該当製品の詳細をご覧になれます。

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E-カドヘリンを足場材に用いた幹細胞培養プレート。ヒトiPS細胞のセレクションと未分化維持培養が一度に可能。その他の幹細胞への利用も文献報告があります。詳細は製品記事をご覧ください。
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細胞培養・再生医療研究カタログ2021-2022 p.27

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E-cad Fc プレート(96well)

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(テクニカルサポート 試薬担当)

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