霊長類ES / iPS細胞に適したガラス化凍結保存液
ステムセルキープ（StemCell Keep）

ステムセルキープは、ガラス化能を高く維持したまま細胞毒性を低く抑えるよう最適化された、霊長類ES / iPS細胞用のガラス化凍結保存液です。

※本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

※ステムセルキープで保存した細胞にトリパンブルー処理する際には、必ず細胞を洗浄してください。

ヒトiPS細胞の凍結保存

ヒトiPS細胞を既存のガラス化凍結液（DAP213）および本製品で1週間凍結保存し、解凍翌日のコロニー形成率および4日後の細胞数（回復率）を非凍結群に対する割合（％）として示した。本製品で凍結した系では明らかに高い保護効果が見られた。

本製品で凍結したヒトiPS細胞の解凍後の未分化マーカーの発現

（A）アルカリホスファターゼ（AP）、（B）OCT-4、（C）SSEA-4、（D）TRA-1-60のいずれも陽性で、未分化状態が維持されていることがわかる。

本製品で凍結したヒトiPS細胞の解凍後の多能性評価

解凍後のiPS細胞を未処理プレート上で培養し、胚様体を作製後、通常の培養プレートにて1週間培養した。三胚葉由来のタンパク質が検出された。

京都大学由来ヒトES細胞（KhES1, KhES3）を本製品で保存後、培養を行い、各種バイオマーカーおよび表現型を分析した。

SNLフィーダー細胞上（A, B）およびMatrigel（BD社製品）をコートしたプレート上（C, D）で培養した。いずれもES細胞が成長している。

5日間培養後、AP（アルカリホスファターゼ）の発現を確認した。

hES1細胞をSNLフィーダー細胞に播種して培養後3, 4, 5, 6日にAP染色を行い、コロニー数を計測すると、本製品で保存した細胞は3日目からコロニーができ、6日目までそのコロニーが大きくなった。DAP213で保存した細胞は2日目では少なく、その後3日目で本製品で保存した細胞と同じくらいのコロニー数になったが、コロニーの大きさは本製品の方が大きかった。

本製品で凍結したES細胞を解凍後、幹細胞マーカーTRA-1-60の発現をフローサイトメトリーにより解析した。

本製品で保存した細胞も、Nanogの発現量はDAP213と同程度であった。
図の紫色の部分がNanog陽性細胞で、緑色の部分はコントロール細胞。
本製品保存分は97.6％が, DAP213保存分は96.2％が陽性であった。

本製品で保存した細胞の核型（カリオタイプ）に変化がないかを確認した。

RT-PCRによる各mRNA発現量の解析は⊿⊿Ct法で行った。その結果、SOX2を1とした時、hES細胞の未分化能を示す転写因子や接着因子について、Nanogを除いて本製品はDAP213と同等の発現率を示した。

ヒトiPS細胞の凍結解凍時におけるステムセルキープとDAP213との比較検討（データ提供：山梨大学）

ヒトiPS細胞の凍結時には、DAP213を使用した簡易ガラス化法が推奨されている。

しかしこの手法には、以下の問題点がある。

・DAP213に含まれるDMSOはOct3/4の発現を抑制する。
・アセトアミドは発がん性を有する。
・DAP213は胚の凍結時に少量の凍結剤として使用されるものであり、細胞保存時の容量の大きい保存には向かない。
・DAP213添加後にわずか15秒以内で液体窒素に浸漬しなければならず、熟練した技術を要する。

ヒトiPS細胞（201B7株、理研BRC）¹ついて、ステムセルキープおよびDAP213を添加後、液体窒素に浸漬するまでの時間を15、45、90秒として、液体窒素中で6日間保存した。解凍後、6日間培養し、その間のコロニー密度、コロニーの大きさ、コロニー面積率を計測した。

コロニー密度

ステムセルキープで凍結したhiPS細胞のコロニー密度は、DAP213添加15秒後に凍結処理を行った場合と同程度の結果であった。DAP213で凍結したhiPS細胞のコロニー形成は、浸漬までの時間に著しく影響を受けるが、ステムセルキープでは浸漬までの時間が解凍後のコロニー形成に与える影響はほとんどなかった（図1、2）。

コロニーの大きさ

図3、4にコロニーの大きさを示した。DAP213で凍結した場合、ステムセルキープで凍結した場合と比較して、コロニーの大きさが若干小さくなる傾向が認められた。粘性の高いステムセルキープではピペッティングによる水勢が抑えられ、結果としてDAP213よりもコロニーが崩れないと考えられる。

コロニーの面積率

hiPS細胞のコロニーは単層で均一な構造を成しているため、コロニーの面積の広さが細胞数をそのまま反映していると考えられる。ステムセルキープで凍結したhiPS細胞のコロニーの占有面積率は、DAP213添加15秒後に凍結処理を行った場合と同程度の結果であった（図5、6）。その中でも、ステムセルキープで添加45秒および90秒後に凍結処理を行った場合に、ばらつきが少なく、安定して解凍後の回復を行えた。

DAP213を用いた凍結は、凍結処理までの時間が短いため熟練した技術を必要とした。しかしながら、ステムセルキープを使用することによって様々な問題が解消される。今回の比較検討では、45秒という凍結に十分な時間を確保しつつ、hiPS細胞の解凍後の回復を十分に果たすことを確認できた、と考える。また、作業に90秒かかったとしても、安定性は低下するが十分な回復が可能であり、作業中に予期せぬ事故などが起こった場合のリスクを回避できる可能性が高い。

ステムセルキープは試薬の粘性が高いため、採取しにくい、混和しにくいという問題点がある。混和の際には、時間をかけても良いので、緩やかにしっかりと5回程度混和する必要がある。

※DAP213を用いた場合のhiPS細胞の生存率は20％程度とされる。

1. Takahashi, K., et al., Cell, 131 (5), 861～872 (2007).

図1：hiPS細胞コロニーの密度

培養面1平方センチメートル当たりのコロニー数を示した。

図2：解凍後6日目におけるコロニーの密度（相対値）

解凍後6日目におけるhiPS細胞のコロニー密度の相対値を示した。DAP213添加15秒後に凍結処理を行ったhiPS細胞のコロニー密度を1としたときの各コロニー密度を示した。

図3：hiPS細胞コロニーの大きさ

培養中に形成したコロニーの大きさを示した。

図4：解凍後6日目におけるコロニーの大きさ（相対値）

解凍後6日目におけるhiPS細胞コロニーの大きさの相対値を示した。DAP213添加15秒後に凍結処理を行ったhiPS細胞の大きさを1とした相対値により示した。

図5：hiPS細胞コロニーの占有面積率

培養面積に対するコロニーの面積の割合を示した。

図6：解凍後6日目におけるコロニーの面積（相対値）

解凍後6日目におけるhiPS細胞コロニーの面積の相対値を示した。DAP213添加15秒後に凍結処理を行ったhiPS細胞の面積を1とした相対値により示した。

図7：培養6日目における培養状態

培養6日目におけるhiPS細胞のコロニーの様相を示した（40倍）。

※目的の細胞で事前に予備試験を実施して下さい。
※高い生存率を得るためには、細胞を保存液に懸濁した後、直ちにバイアルを液体窒素中へ浸漬する必要があります。事前に十分に準備をしてから操作を開始して下さい。また、解凍時もバイアルにあらかじめ温めた培地を添加して、すぐに溶解させた方が生存率は高まります。

本製品は、小包装のサンプル品をご用意しています。ご希望の方は専用申込みフォームに必要事項をご記入の上、ご利用の販売店ご担当者へお渡し下さい。

微細金型加工技術を応用した、高精度なディスポーザブル細胞計算盤です。1枚の計算盤で4種類の試料を計測できるため、コストパフォーマンスに優れた製品です。
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