世界初，生細胞の脂肪酸β酸化（FAO）活性を蛍光定量できる試薬 FAOBlue

脂肪酸分解の共通経路である脂肪酸β酸化（FAO）活性を，青色蛍光で可視化する試薬です。
従来測定することが難しかった，生細胞での脂肪酸β酸化の活性を蛍光イメージングによって簡便に測定可能です。
細胞種ごとのβ酸化活性の比較評価，β酸化活性の促進または阻害化合物の探索，β酸化に関わる酵素群の基礎研究など幅広く応用可能です。

※本製品は九州大学大学院薬学研究院創薬ケミカルバイオロジー分野　王子田彰夫教授の研究成果をもとに，フナコシ株式会社が製品化し，販売しています。
※本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

FAOBlueを用いたHepG2細胞のFAO活性の可視化
HepG2細胞にFAOBlueを添加し，生細胞イメージングで観察したところ，細胞より青色蛍光が観察された。一方で，FAOの阻害剤を前処理すると蛍光強度が著しく減少していたことから，青色蛍光はFAO活性に依存することが分かる。
（詳細は下記のデータ例：さまざまな細胞種におけるFAO活性の可視化をご参照下さい）

FAOBlueは炭素数9のノナン酸の炭素鎖末端に青色蛍光色素クマリンの誘導体を付与した化合物で，さらに末端の脂肪酸をアセトキシメチルエステルで保護することで細胞膜透過性を向上しています。FAOBlueはクマリン誘導体を有しますが，この状態では405 nm励起において蛍光を発しません。

Uchinomiya, S., et. al., Chem. Commun. 56, 3023～3026 (2020) .
”Fluorescence Detection of Metabolic Activity of Fatty Acid Beta Oxidation Pathway in Living Cells.”

本試薬は405 nmの励起光を使用するため，観察対象によっては自家蛍光が観察される場合があります。本試薬を添加していないネガティブコントロールを並行して実施することを推奨しています。特に顕微鏡観察時にドット状の蛍光シグナルが観察される場合，自家蛍光に起因する可能性があります。

FAOBlueおよびクマリン誘導体の吸収スペクトル（左）および蛍光スペクトル（右）。
FAOBlueはFAOによりクマリン誘導体に変換されることで，吸収極大が350 nm→405 nmに長波長シフトする。そのため，405 nm励起条件下では，FAOBlueは蛍光を示さず，FAOによりクマリン誘導体が放出されたときのみ青色蛍光を生じる。

※注意：
FAOBlueの吸収極大350 nm付近の光で励起すると，FAOBlueも青色蛍光（380～450 nm; 極大波長400 nm）が生じます。蛍光顕微鏡における一般的なDAPIフィルターを用いると，未反応のFAOBlueとFAO反応後のクマリン誘導体の両方が励起されてしまいます。フィルターの選択には十分ご注意下さい。

4種類のがん細胞にFAOBlueを添加し，一定時間培養後に蛍光観察した。いずれの細胞からも青色蛍光が観察され，FAO阻害剤etomoxirを添加すると蛍光が著しく減衰したことから，青色蛍光はFAO活性に起因することが分かる。

HepG2細胞に脂質代謝促進剤AICAR^＊2（200μM，3時間）または部分的FAO阻害剤ranolazine（200μM, 12時間）を添加し前処理した後，FAOBlue（5μM）を添加し30 分培養した。蛍光観察を行うと，コントロール（未処理）に比べ，AICARで有意に蛍光強度が向上し，ranolazineで有意に低下していることが分かった。
＊2 AICAR : AMPK（AMP-activated protein kinase）活性化剤で脂質代謝を活性化する働きがある

FAOBlueを用いることで薬剤がFAOに与える効果を定量的に解析することができる。HepG2細胞を非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）の治療薬候補であるND-630（acetyl-CoA carboxylase inhibitor）で4時間前処理した後，FAOBlue（5μM）を添加し30分培養した。 共焦点レーザー顕微鏡で青色蛍光強度を評価するとND630濃度依存的な蛍光強度の上昇が観察された。ND-630によりFAO活性が亢進していることがわかる。

非アルコール性肝炎（NASH）は脂肪分解速度が低下することが知られる脂質関連疾患である。正常マウスおよびNASHモデルマウスに対し，脂質代謝を亢進するbezafibrateを経口投与したのち，肝臓を回収し初代培養肝細胞を調製した。各細胞にFAOBlue（5μM）を添加しFAO活性を観察したところ，正常マウス由来細胞に比べ，NASHモデルマウス由来細胞で著しいFAO活性の抑制が見られた。一方，bezafibrateを投与したNASHモデルマウス由来細胞では，FAO活性の回復が見られた。
本試薬は，脂質関連疾患モデルにおけるFAOの定量解析に有用である。