フナコシニュース連載企画 「FRONTIERS」PolyPlus Transfectionの紹介

掲載日情報:2018/06/01 現在Webページ番号:65161

Frontiers

Vol. 30 The Delivery Experts

Polyplus-Transfection 社はフランスに本拠を置く,トランスフェクション試薬のメーカーです。
核酸導入分野で20 年以上にわたり培ってきたノウハウに基づき,様々な導入物質/導入対象に対応する製品ラインナップを揃えています。2002 年にはISO 9001 を取得しており,一部の製品は世界中で臨床試験にも使用されています。
今回は同社のGenome Editing Project Leader であるValérie Toussaint 氏に,同社の新製品 jetCRISPR についてお話を伺いました。

 Frontiers


トランスフェクションはゲノム編集成功の鍵

CRISPR/Cas9 を用いたゲノム編集には,Cas9 タンパク質とguideRNA の細胞への導入が必要です。ゲノム編集を成功させるためにはこれらを細胞内のターゲットへ確実に届けることが重要です。
つまり,トランスフェクションは鍵となるステップといえます。ゲノム編集に適した試薬を選ぶことが重要です。
トランスフェクションはゲノム編集成功の鍵
哺乳動物細胞の場合,Cas9 タンパク質とguideRNA の導入には3 種類のアプローチがあり,私たちは各手法に適した製品を取りそろえています。(図)
①DNA :Cas9 タンパク質,guideRNA をコードしたプラスミドの導入 - jetPRIME
②RNA :Cas9 をコードしたmRNA とguideRNA の導入 - jetMESSENGER
③RNP(リボ核タンパク質) :精製Cas9 タンパク質とguideRNA の複合体の導入 - jetCRISPR

研究室で広く用いられているのはCas9 とguideRNA をプラスミドDNA で導入する手法①ですが,トランスフェクションが困難な初代細胞やがん細胞には不向きです。



メリットが多い,RNP を直接導入するゲノム編集

近年,ゲノム編集研究のトレンドは,Cas9 タンパク質をguideRNA と同時に導入する手法③にシフトしてきました。
タンパク質での導入は,オフターゲットの低減など多くのメリットがあるアプローチです。

  • 短時間で効率よく編集できる
    (転写・翻訳が不要,活性Cas9-guideRNA 複合体が細胞に直接送達される)
  • オフターゲットが最小限に抑えられる
    (トランスフェクション後,迅速に分解される(Cas9 クリアランスが速い)
  • 困難な細胞にも簡単に導入可能
  • guideRNA スクリーニングが簡単
  • 細胞生存率が高い

ゲノム編集に最適化されたトランスフェクション試薬 jetCRISPR

私たちが新たに開発したトランスフェクション試薬  jetCRISPR は,RNP トランスフェクション(Cas9 タンパク質とguideRNA の同時導入)のための製品です。
より高いゲノム編集効率を実現するため,私たちはguideRNA とCas9 タンパク質の濃度や存在比率,Cas9 タンパク質配列についても検証・最適化を行いました。
jetCRISPR との併用によりベストなゲノム編集効率が得られるSpCas9 Nuclease も開発,販売しています。
これら2 製品を組み合わせて使用することで,他社製品よりも高いゲノム編集効率を実現できます。

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HeLa細胞へのCas9/gRNA複合体の導入

本製品を用いてCas9タンパク質とHPRT1 sgRNAまたはネガティブコントロールの複合体(RNP)を各濃度でHeLa細胞へ導入した。導入48時間後,DNAを抽出し,ゲノム編集のターゲットとした領域をPCR増幅した。T7エンドヌクレアーゼ処理によりミスマッチした二本鎖を形成した産物を切断した後,アガロースゲルで電気泳動した。
トランスフェクションされた細胞由来の産物(ゲノム編集により変異が生じている)と未導入細胞由来の産物から,ゲノム編集効率を算出できる。
1083 bp:切断されていない断片, 827 bp:切断された長い断片,256 bp:切断された短い断片



ゲノム編集専用トランスフェクション試薬 jetCRISPR

jetCRISPR

CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集において,Cas9タンパク質とガイドRNA(gRNA)の細胞への同時導入に最適なトランスフェクション試薬です。 高いゲノム編集効率と細胞生存率が得られます。

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ゲノム編集に有用なPolyPlus社トランスフェクション試薬ラインナップ

vitro / vivo 導入分子 Cas9 ガイドRNA 品名
in vitro タンパク質/RNA タンパク質(上記 SpCas9 Nuclease) RNA jetCRISPR(本製品)
in vitro DNA DNA DNA jetPRIME
in vitro DNA/RNA DNA RNA jetPRIME
in vitro RNA mRNA RNA jetMESSENGER
in vivo DNA DNA DNA in vivo-jetPEI

メーカー動画:ゲノム編集におけるトランスフェクションのトレンド

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トランスフェクション試薬ガイドはこちら

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お問い合わせ先

(テクニカルサポート 試薬担当)

reagent@funakoshi.co.jp

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