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生細胞検出用蛍光バイオセンサー Red/Green DAG BacMam Assay

掲載日情報:2018/05/09 現在Webページ番号:64589

Red/Green DAG BacMamは,DAG(diacylglycerol)と特異的に結合することにより蛍光強度が上昇または減衰する蛍光タンパク質を応用した蛍光バイオセンサーです。この蛍光バイオセンサーは,従来困難であった生細胞におけるDAGの動的挙動の継時測定,局在性の観察およびcAMPやPIP2などの他のセカンドメッセンジャーとのマルチプレックスアッセイを,蛍光プレートリーダーまたは蛍光顕微鏡による画像解析システムを用いて簡便に行うことができます。
本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

TRPC6陽イオンチャネル

TRPC6陽イオンチャネルは,血管けいれんや糸球体硬化症などの心血管および腎機能障害に関与しています。近年,Stark Neurosciences Research InstituteのSasha Obukhov’s のチームとインディアナ大学 らにより,DAG BacMam Assayを用いて,TRPC6活性調節におけるH1R(histamine receptor)の役割に関する研究が報告されました*

MEMO

Red/Green DAG BacMam Assayとは


ELISA法に代表される従来のDAG(diacylglycerol)の測定法は,細胞溶解など煩雑な操作が必要で,またエンドポイント測定のために生細胞における動的挙動について理解を得ることは困難でした。Red/Green DAG BacMam Assayでは,哺乳動物の生細胞において,DAGに結合して蛍光が増大(Upward Kit)または減少(Downward Kit)する蛍光タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを使用しています。これらの発現ベクターは哺乳細胞において非増殖の改変型バキュロウイルス(BacMam)として供給され,標的培養細胞に感染することにより発現しDAGと結合することにより,一過性のDAG感応性蛍光バイオセンサーとして機能します。
DAGはGPCRシグナリング(Gqシグナリング)のセカンドメッセンジャーであるため,GPCRシグナリングの増幅または抑制する化合物のスクリーニングや,外部刺激に対する細胞レベルでのシグナル応答研究に最適です。

<span style=Upward sensor Downward sensor" width="600" />


蛍光バイオセンサー製品の種類

Target factorの種類をクリックすると個々の製品の詳細な説明,商品コードをクリックすると価格表を直接ご覧いただけます。

Target factor 標的経路 プロモーター 細胞種 蛍光シグナル 測定方法 商品コード
Plate Imaging
cAMP Gs CMV Non-neuronal / whole cell Green Upward U0200G
Downward D0200G
Red Upward U0200R
Non-neuronal / primary-cilia Green Downward D0201G
Synapsin* Neuron / whole cell Green Upward U0202G
Downward D0202G
cAMP Gi CMV Non-neuronal / whole cell Green Downward X0200G
DAG Gq CMV Non-neuronal / whole cell Green Upward U0300G
Downward D0300G
Red Upward U0300R
Downward D0300R
PIP2 Gq CMV Non-neuronal / whole cell Green Upward D0400G
Red D0400R
Ca2+ Gq CMV Non-neuronal / whole cell Red Upward U0600R
Voltage CMV Non-neuronal / whole cell Green Upward U0700G
Synapsin* Neuron / whole cell U0701G
Cellular stress Endoplasmic Reticulum (ER) and ER Unfolded Protein Response CMV HEK293 cells
(Adherent cells and iPSC-derived lines)
Green Upword Cell Stress Sensor Upward U0900G
Green Upword Cell Stress Sensor with constitutive red fluorescent protein for ratiometric measurement. U0901G

測定方法:Plate=プレートリーダー,Imaging=顕微鏡

Synapsinプロモーターを用いた蛍光バイオセンサーは,神経細胞に特異的に感染して発現されますが,発現量が少ないために一般の蛍光プレートリーダーによる測定は困難でありお勧めしません。神経細胞で蛍光プレートリーダーを用いて解析を行う必要がある場合には,高発現が可能なCMVプロモーターの製品をご使用下さい。ただし,CMVプロモーターの蛍光バイオセンサーは神経細胞に対する特異性がないために,同じ神経系を構成するグリア細胞においても発現することにご留意下さい。

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特長

  • 安定性の高い蛍光により,哺乳動物細胞または神経細胞内におけるDAGの継時変化の測定が行えます。
  • 添加するバキュロウイルス量に応じて,センサー発現量を簡単に調節することが可能です。
  • 自動蛍光プレートリーダーおよびイメージングシステムに対応しています。
  • 哺乳動物生細胞を標的としたスクリーニングが可能です。
  • 簡便なシングルステップアッセイです。補酵素や細胞溶解の操作は不要です。
  • 異なる蛍光センサー製品を組み合わせて用いることにより,Gs, GqおよびGiの複数のシグナル伝達経路の多重測定を簡便に行うことができます。
  • プロトコルはHEK293細胞に最適化されていますが,その他の哺乳動物の細胞株,初代培養細胞に用いることができます。 ⇒ 使用実績のある細胞種
  • 測定回数:4×96 wellプレート分の試薬が含まれています。
  • 測定波長
蛍光色素の種類 励起波長(nm) 測定波長(nm)
Green 450~490 510~550
Red 550~590 600~700


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画像解析における製品の選択基準

Upward Kitを利用した場合にはDAG分子の局在と蛍光シグナルが同調するため,DAGの局在性を直接観察することができます。しかし,もともとの蛍光バックグラウンドが高い場合では,蛍光シグナルの増幅の確認が困難になるためにDownward Kitの使用をご検討下さい。Downward Kitを使用した場合,DAG分子の局在に対応して蛍光シグナルが消光することから,もともとの蛍光バックグラウンドが高くUpward Kitでの解析が困難な場合に有効です。この場合,細胞全体の蛍光シグナルの初期値から差分を取った減衰値によりDAGの局在性の解析を行うことが可能です。

センサーの種類 蛍光シグナル 用途・選択基準
Upward Kit 上昇 蛍光バックグラウンドが低い場合に使用可能
Downward Kit 減衰 蛍光バックグラウンドが高い場合に有用


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マルチプレックスアッセイへの応用例

(1)

DAG <span style=Upward sensor Downward sensor" width="700" />

Green DAG Upward sensor(#U0300G) とRed PIP2 sensor(#D0400R)を用いてDAGとPIP2のマルチプレックス測定をおこなった。蛍光顕微鏡(図A)および蛍光プレートリーダー(図B)で観察した。

(2)

DAG <span style=Upward sensor Downward sensor" width="700" />

AGreen DAG BacMam Upward Assay (#U0300G) とRed GECO Ca2+ Sensor(#U0600R) を用いた,生細胞におけるGqシグナリングとCa2+の継時変化の同時測定例

BRed GECO Ca2+ Sensor(#U0600R) とGreen DAG BacMam Downward Assay(#D0300G)を用いた,生細胞におけるGqシグナリングとCa2+の継時変化の同時測定例

(3)Green DAG BacMam Downward Assay(#D0300G)

<span style=Green DAG BacMam Downward Assay" width="700" />

A上図Green DAG BacMam Upward Assay (#U0300G)を用いたCarbachol添加によるmuscarinic acetylcholine(M1)レセプターを介するGqシグナリング活性化の測定。
A下図Green DAG BacMam Upward Assay (#U0300G)を用いたATP添加によるP2Y11レセプターを介するGqシグナリング活性化の測定。

ATPによるヒトP2Y11レセプターの活性化

B図Green DAG BacMam Upward Assay (#D0300G)とRed GECO Ca2+ Sensor(#U0600R)を用いたCarbachol添加,無添加時の蛍光シグナル比(⊿F/F)の分布図(B図)。

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操作方法概要

操作方法概要
  1. 細胞を播種する。
  2. BacMam(ウイルス)と添付のSodium butyrate(HDAC阻害剤)を培地に混ぜて細胞に添加する。
  3. 6時間後に培地交換し18時間培養する。
  4. センサータンパク質が発現する。
  5. 任意のアゴニスト/化合物を添加する。
  6. 蛍光プレートリーダーまたは蛍光顕微鏡で継時的に測定および観察を行う。

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キット内容

  • DAG sensor in BacMam*
  • Sodium butylate
  • M1 muscarinic acetylcholine receptor in BacMam
  • Carbachol

* キットにより内容が異なります。
測定には,96-wellマイクロプレート,DPBS(Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline)が必要です。

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参考文献

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価格

[在庫・価格 :2019年04月18日 23時06分現在]

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Green PIP2 Sensor in BacMam(400 assay, 10mL)

文献数:0

  • 商品コード:D0400G
  • メーカー:MOM
  • 包装:1kit
  • 価格:¥131,000
  • 在庫:無(未発注)
  • 納期:2週間程度 
  • 法規制等:カルタヘナ該当品

説明文 哺乳動物細胞内で,PIP2と特異的に結合することにより蛍光強度が上昇する蛍光バイオセンサー。蛍光プレートリーダーまたは蛍光顕微鏡を用いた画像解析により,生細胞におけるPIP2の動的挙動を簡便かつ継時的に測定することができる。測定波長:励起 450~490 nm,蛍光 510~550 nm。 ※ウイルスベクター関連製品のため,購入時に使用者確認書が必要です。
法規制等 カルタヘナ該当品
保存条件 4℃,暗所保存 法規備考
掲載カタログ ニュース2017年11月1日号 p.19
ニュース2017年8月1日号 p.7

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Red PIP2 Sensor in BacMam(5mL)

文献数:0

  • 商品コード:D0400R
  • メーカー:MOM
  • 包装:1kit
  • 本製品は取扱中止になりました

説明文
法規制等 カルタヘナ該当品
保存条件 法規備考
掲載カタログ

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中止

Red PIP2 Sensor in BacMam(400 assay, 10mL)

文献数:0

  • 商品コード:D0400R
  • メーカー:MOM
  • 包装:1kit
  • 価格:¥131,000
  • 在庫:無(未発注)
  • 納期:2週間程度 
  • 法規制等:カルタヘナ該当品

説明文 哺乳動物細胞内で,PIP2と特異的に結合することにより蛍光強度が上昇する蛍光バイオセンサー。蛍光プレートリーダーまたは蛍光顕微鏡を用いた画像解析により,生細胞におけるPIP2の動的挙動を簡便かつ継時的に測定することができる。測定波長:励起 550~590 nm,蛍光 600~700 nm。 ※ウイルスベクター関連製品のため,購入時に使用者確認書が必要です。
法規制等 カルタヘナ該当品
保存条件 4℃,暗所保存 法規備考
掲載カタログ ニュース2017年11月1日号 p.19
ニュース2017年8月1日号 p.7

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reagent@funakoshi.co.jp

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