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生細胞検出用蛍光バイオセンサー Red/Green DAG BacMam Assay

掲載日情報：2020/06/12 現在Webページ番号：64589

モンタナ モレキュラ /
Montana Molecular
[メーカー略称：MOM]

Red/Green DAG BacMamは、DAG（diacylglycerol）と特異的に結合することにより蛍光強度が上昇または減衰する蛍光タンパク質を応用した蛍光バイオセンサーです。この蛍光バイオセンサーは、従来困難であった生細胞におけるDAGの動的挙動の継時測定、局在性の観察およびcAMPやPIP2などの他のセカンドメッセンジャーとのマルチプレックスアッセイを、蛍光プレートリーダーまたは蛍光顕微鏡による画像解析システムを用いて簡便に行うことができます。
※ Montana Molecular社のセカンドメッセンジャーアッセイキットの特長についてはこちらもご覧下さい。
※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。


TRPC6陽イオンチャネル

TRPC6陽イオンチャネルは、血管けいれんや糸球体硬化症などの心血管および腎機能障害に関与しています。近年、Stark Neurosciences Research InstituteのSasha Obukhov’s のチームとインディアナ大学 らにより、DAG BacMam Assayを用いて、TRPC6活性調節におけるH1R（histamine receptor）の役割に関する研究が報告されました*。

* Xingjuan, C., et al., PCK-dependent Phosphorylation of the H1 Histamine Receptor Modulates TRPC6 Activity. Cells, 3(2), 247～257(2014).

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Red/Green DAG BacMam Assayとは

ELISA法に代表される従来のDAG（diacylglycerol）の測定法は、細胞溶解など煩雑な操作が必要で、またエンドポイント測定のために生細胞における動的挙動について理解を得ることは困難でした。Red/Green DAG BacMam Assayでは、哺乳動物の生細胞において、DAGに結合して蛍光が増大（Upward Kit）または減少（Downward Kit）する蛍光タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを使用しています。これらの発現ベクターは哺乳細胞において非増殖の改変型バキュロウイルス（BacMam)として供給され、標的培養細胞に感染することにより発現しDAGと結合することにより、一過性のDAG感応性蛍光バイオセンサーとして機能します。
DAGはGPCRシグナリング（Gqシグナリング）のセカンドメッセンジャーであるため、GPCRシグナリングの増幅または抑制する化合物のスクリーニングや、外部刺激に対する細胞レベルでのシグナル応答研究に最適です。

Downward / Upward sensor


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蛍光バイオセンサー製品の種類

※Target factorの種類をクリックすると個々の製品の詳細な説明、商品コードをクリックすると価格表を直接ご覧いただけます。

Target factor標的経路プロモーター細胞種色蛍光シグナル測定方法商品コード
PlateImaging
cAMPGsCMVNon-neuronal / whole cellGreenUpward●●U0200G
Downward●●D0200G
RedUpward●●U0200R
Non-neuronal / primary-ciliaGreenDownward●●D0201G
cAMPGiCMVNon-neuronal / whole cellGreenDownward●●X0200G
DAGGqCMVNon-neuronal / whole cellGreenUpward●●U0300G
Downward●●D0300G
RedUpward●●U0300R
PIP2GqCMVNon-neuronal / whole cellGreenUpward●●D0400G
Red●●D0400R
Ca2+GqCMVNon-neuronal / whole cellRedUpward●●U0600R
Voltage－CMVNon-neuronal / whole cellGreenUpward●●D0700G
Cellular stressEndoplasmic Reticulum (ER) and ER Unfolded Protein ResponseCMVHEK293 cells
(Adherent cells and iPSC-derived lines)		Green Upword Cell Stress SensorUpward●●U0900G
Green Upword Cell Stress Sensor with constitutive red fluorescent protein for ratiometric measurement.●●U0901G

測定方法：Plate=プレートリーダー、Imaging=顕微鏡


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特長

  • 安定性の高い蛍光により、哺乳動物細胞または神経細胞内におけるDAGの継時変化の測定が行えます。
  • 添加するバキュロウイルス量に応じて、センサー発現量を簡単に調節することが可能です。
  • 自動蛍光プレートリーダーおよびイメージングシステムに対応しています。
  • 哺乳動物生細胞を標的としたスクリーニングが可能です。
  • 簡便なシングルステップアッセイです。補酵素や細胞溶解の操作は不要です。
  • 異なる蛍光センサー製品を組み合わせて用いることにより、Gs, GqおよびGiの複数のシグナル伝達経路の多重測定を簡便に行うことができます。
  • プロトコルはHEK293細胞に最適化されていますが、その他の哺乳動物の細胞株、初代培養細胞に用いることができます。　⇒ 使用実績のある細胞種
  • 測定回数：4×96 wellプレート分の試薬が含まれています。
  • 測定波長
蛍光色素の種類励起波長（nm）測定波長（nm）
Green485～505515～535
Red550～590600～700


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画像解析における製品の選択基準

Upward Kitを利用した場合にはDAG分子の局在と蛍光シグナルが同調するため、DAGの局在性を直接観察することができます。しかし、もともとの蛍光バックグラウンドが高い場合では、蛍光シグナルの増幅の確認が困難になるためにDownward Kitの使用をご検討下さい。Downward Kitを使用した場合、DAG分子の局在に対応して蛍光シグナルが消光することから、もともとの蛍光バックグラウンドが高くUpward Kitでの解析が困難な場合に有効です。この場合、細胞全体の蛍光シグナルの初期値から差分を取った減衰値によりDAGの局在性の解析を行うことが可能です。

センサーの種類蛍光シグナル用途・選択基準
Upward Kit上昇蛍光バックグラウンドが低い場合に使用可能
Downward Kit減衰蛍光バックグラウンドが高い場合に有用


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マルチプレックスアッセイへの応用例

(1)

DAG <span style=Upward sensor Downward sensor" width="700" />

Green DAG Upward sensor(#U0300G) とRed PIP2 sensor(#D0400R)を用いてDAGとPIP2のマルチプレックス測定をおこなった。蛍光顕微鏡（図A）および蛍光プレートリーダー（図B）で観察した。

(2)

DAG <span style=Upward sensor Downward sensor" width="700" />

A：Green DAG BacMam Upward Assay (#U0300G) とRed GECO Ca2+ Sensor(#U0600R) を用いた、生細胞におけるGqシグナリングとCa2+の継時変化の同時測定例

B：Red GECO Ca2+ Sensor(#U0600R) とGreen DAG BacMam Downward Assay(#D0300G)を用いた、生細胞におけるGqシグナリングとCa2+の継時変化の同時測定例

(3)Green DAG BacMam Downward Assay(#D0300G)

<span style=Green DAG BacMam Downward Assay" width="700" />

A上図：Green DAG BacMam Upward Assay (#U0300G)を用いたCarbachol添加によるmuscarinic acetylcholine(M1)レセプターを介するGqシグナリング活性化の測定。
A下図：Green DAG BacMam Upward Assay (#U0300G)を用いたATP添加によるP2Y11レセプターを介するGqシグナリング活性化の測定。

ATPによるヒトP2Y11レセプターの活性化

B図：Green DAG BacMam Upward Assay (#D0300G)とRed GECO Ca2+ Sensor(#U0600R)を用いたCarbachol添加、無添加時の蛍光シグナル比（⊿F/F）の分布図（B図)。

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操作方法概要

操作方法概要
  1. 細胞を播種する。
  2. BacMam（ウイルス）と添付のSodium butyrate（HDAC阻害剤）を培地に混ぜて細胞に添加する。
  3. 6時間後に培地交換し18時間培養する。
  4. センサータンパク質が発現する。
  5. 任意のアゴニスト／化合物を添加する。
  6. 蛍光プレートリーダーまたは蛍光顕微鏡で継時的に測定および観察を行う。

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キット内容

  • DAG sensor in BacMam*
  • Sodium butylate
  • M1 muscarinic acetylcholine receptor in BacMam
  • Carbachol

* キットにより内容が異なります。
※ 測定には、96-wellマイクロプレート、DPBS（Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline）が必要です。

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参考文献

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説明文 。 哺乳動物細胞内で，DAG（diacylglycerol）と特異的に結合することにより蛍光強度が上昇する蛍光タンパク質を応用した蛍光バイオセンサー。蛍光プレートリーダーまたは蛍光顕微鏡を用いた画像解析により，生細胞におけるDAGの動的挙動を簡便かつ継時的に測定することができる。測定波長：励起 550～590 nm，蛍光 600～700 nm。
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■ 関連製品：PIP2 BacMam Assay

生細胞におけるPIP2の挙動を簡便かつ継時的に測定することができるキットです。

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（テクニカルサポート 試薬担当）

reagent@funakoshi.co.jp

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