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生細胞検出用蛍光バイオセンサー Red/Green DAG Big Sky BacMam Assay

掲載日情報：2020/06/12 現在Webページ番号：64589

モンタナ モレキュラ /
Montana Molecular
[メーカー略称：MOM]

Red/Green DAG Big Sky BacMamは、DAG（diacylglycerol）と特異的に結合することにより蛍光強度が上昇または減衰する蛍光タンパク質を応用した蛍光バイオセンサーです。この蛍光バイオセンサーは、従来困難であった生細胞におけるDAGの動態の経時測定、局在の観察およびcAMPやPIP2などの他のセカンドメッセンジャーとのマルチプレックスアッセイを、蛍光プレートリーダーまたは蛍光顕微鏡によるイメージングシステムを用いて簡便に実施できます。
目的細胞へのバイオセンサー導入に用いるバキュロウイルスベクターは、HEK293細胞およびCHO細胞で導入効率の向上が示された改良型ベクターBig Sky BacMamに変更されました。

※ Montana Molecular社のセカンドメッセンジャーアッセイキットの特長についてはこちらもご覧下さい。
※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。


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Red/Green DAG Big Sky BacMam Assayとは

ELISA法に代表される従来のDAG（diacylglycerol）の測定法は、細胞溶解など煩雑な操作が必要で、またエンドポイント測定のために生細胞における動的挙動について理解を得ることは困難でした。Red/Green DAG Big Sky BacMam Assayでは、哺乳動物の生細胞において、DAGに結合して蛍光が増大（Upward Kit）または減少（Downward Kit）する蛍光タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを使用しています。これらの発現ベクターは哺乳細胞において非増殖の改変型バキュロウイルスとして供給され、標的細胞へ導入後に一過性に発現し、DAG応答性蛍光バイオセンサーとして機能します。
DAGは、Gq共役GPCRシグナル伝達の下流で生じるセカンドメッセンジャーであるため、GPCRシグナル伝達を増強または抑制する化合物のスクリーニングや、外部刺激に対する細胞レベルでのシグナル応答研究に最適です。

Downward / Upward sensor
DAG-Sensor-mechanism

BacMamベクターとBig Sky BacMamベクターの比較

HEK293T細胞に対する従来型ベクターBacMamおよび改良型ベクターBig Sky BacMamの導入効率
従来型ベクターBacMamおよび改良型ベクターBig Sky BacMamを用いてmNeon Green遺伝子をHEK293T細胞に導入し、その蛍光強度で導入効率を比較した
HEK293T細胞において、同一条件で比較したところ、24時間後の蛍光強度は3～4倍に向上した。

画像内容説明
従来型ベクターBacMamおよび改良型ベクターBig Sky BacMamを用いてmNeon Green遺伝子をCHO細胞に導入し、その蛍光強度で導入効率を比較した
それぞれの導入効率を24時間後および48時間後の蛍光シグナルで比較した。48時間後では、改良型であるBig Sky BacMamベクターは従来型ベクターBacMamと比較して約9倍の遺伝子導入効率を示した。なお、本結果は従来推奨していたspinoculation処理を行わずに得られた。

使用文献情報

  • Chen, X., et al., Cells, 3(2), 247-257(2014). [PMID:24709960]

TRPC6陽イオンチャネルは、血管攣縮や糸球体硬化症などの心血管および腎機能障害に関与しています。インディアナ大学のObukhov, A. G.らにより、DAG BacMam Assayを用いて、TRPC6活性調節におけるH1R（histamine receptor）の役割に関する研究が報告されました。



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蛍光バイオセンサー製品の種類

※商品コードをクリックすると価格表をご覧いただけます。

Target factor 標的経路 プロモーター 細胞種 色 蛍光シグナル 測定方法 商品コード
Plate Imaging
DAG Gq CMV Non-neuronal / whole cell Green Upward ● ● U0350G
Downward ● ● D0350G
Red Upward ● ● U0350R
Downward ● ● D0350R

測定方法：Plate=プレートリーダー、Imaging=顕微鏡


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特長

  • 安定性の高い蛍光により、哺乳動物細胞または神経細胞内におけるDAGの経時変化の測定が行えます。
  • 添加するバキュロウイルス量に応じて、センサー発現量を簡単に調節することが可能です。
  • 自動蛍光プレートリーダーおよびイメージングシステムに対応しています。
  • 哺乳動物生細胞を標的としたスクリーニングが可能です。
  • 操作は簡便で、補酵素の添加や細胞溶解は不要です。
  • 異なる蛍光センサー製品を組み合わせて用いることにより、Gs、GqおよびGiの複数のシグナル伝達経路の多重測定を簡便に行うことができます。
  • プロトコルはHEK293細胞に最適化されていますが、その他の哺乳動物の細胞株、初代培養細胞に用いることができます。
  • 測定回数：4×96 wellプレート分の試薬が含まれています。
  • 測定波長
蛍光色素の種類 励起波長（nm） 測定波長（nm）
Green 485～505 515～535
Red 550～590 600～700


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イメージングシステムを用いた解析における製品の選択基準

Upward Kitを利用した場合にはDAG分子の局在と蛍光シグナルが同調するため、DAGの局在を直接観察することができます。しかし、もともとの蛍光バックグラウンドが高い場合では、蛍光シグナルの増幅の確認が困難になるためにDownward Kitの使用をご検討下さい。Downward Kitを使用した場合、DAG分子の局在に対応して蛍光シグナルが低下することから、もともとの蛍光バックグラウンドが高くUpward Kitでの解析が困難な場合に有効です。この場合、細胞全体の蛍光シグナルの初期値から差分を取った減衰値によりDAGの局在性の解析を行うことが可能です。

センサーの種類蛍光シグナル用途・選択基準
Upward Kit上昇蛍光バックグラウンドが低い場合に使用可能
Downward Kit減衰蛍光バックグラウンドが高い場合に有用


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マルチプレックスアッセイへの応用例

※ 本項のデータは従来のBacMam（販売終了品）にて取得。

1.Green DAG Upward sensorとRed PIP2 sensorを用いたDAGとPIP2のマルチプレックス測定

DAG Upward sensor Downward sensor

Green DAG Upward sensorとRed PIP2 sensorを用いてDAGとPIP2のマルチプレックス測定を行った。蛍光顕微鏡（図A）および蛍光プレートリーダー（図B）で観察した。


2. Green DAG sensorとRed GECO Ca2+ Sensorを用いた生細胞におけるGqシグナリングとCa2+の経時変化の同時測定

DAG Upward sensor Downward sensor
A：Green DAG BacMam Upward Assay とRed GECO Ca2+ Sensor を用いた、生細胞におけるGqシグナリングとCa2+の経時変化の同時測定例
B：Green DAG BacMam Downward Assayと、Red GECO Ca2+ Sensorを用いた、生細胞におけるGqシグナリングとCa2+の経時変化の同時測定例


3. Green DAG sensorとRed GECO Ca2+ Sensorを用いたGqシグナリング活性化の測定

Green DAG BacMam Downward Assay
A上図：Green DAG BacMam Upward Assayを用いたCarbachol添加によるムスカリン性アセチルコリンレセプターM1（Muscarinic acetylcholine receptor M1）を介するGqシグナリング活性化の測定。
A下図：Green DAG BacMam Upward Assayを用いたATP添加によるP2Y11レセプターを介するGqシグナリング活性化の測定。
B図：ATPによるヒトP2Y11レセプターの活性化
Green DAG BacMam Upward AssayとRed GECO Ca2+ Sensorを用いたCarbachol添加、無添加時の蛍光シグナル比（⊿F/F）の分布図（B図)。



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操作方法概略

cADDis cAMP BacMam Assayの操作方法概略
  • 1日目：細胞へのトランスダクションおよび播種
    • ステップ1：ウイルス導入用試薬を調製
    • ステップ2：細胞の調製
    • ステップ3：ウイルス導入用試薬と細胞を混合
  • 2日目：ライブセルアッセイ
    • ステップ4：培養培地をDPBSに置換
    • ステップ5：蛍光を測定


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キット内容

  • DAG sensor in Big Sky BacMam*
  • Sodium butyrate
  • hM1 muscarinic control receptor in BacMam*
  • Carbachol

* キットにより内容が異なります。
※ 測定には、96ウェルマイクロプレート、DPBS（Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline）が必要です。

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参考文献

  1. Shigeto, M., et al., J. Clin. Invest., 125(12), 4714-4728(2015). [PMID:26571400]
  2. Tewson, P. H., et al., J. Biomol. Screen., 21(3), 298-305(2016). [PMID:26657040]
  3. Arttamangkul, S., et al., Br. J. Pharmacol., 172(2), 583-592(2015). [PMID:24697621]
  4. Chen, X., et al., Cells, 3(2), 247-257(2014). [PMID:24709960]
  5. Tewson, P., et al., PLoS One, 7(8), e42791(2012). [PMID:22912738]


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[在庫・価格 ：2026年06月26日 00時01分現在]

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関連製品：PIP2 Big Sky BacMam Assay

生細胞におけるPIP2の挙動を簡便かつ経時的に測定することができるキットです。

※ 商品コードをクリックすると価格表をご覧いただけます。

Target factor 標的経路 プロモーター 細胞種 色 蛍光シグナル 測定方法 商品コード
Plate Imaging
PIP2 Gq CMV Non-neuronal / whole cell Green Downward ● ● D0450G
Red ● ● D0450R


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関連製品：MOM社2ndメッセンジャー測定用蛍光バイオセンサー

※ Target factorの種類をクリックすると個々の製品の詳細な説明、商品コードをクリックすると価格表をご覧いただけます。

Target factor 標的経路 プロモーター 細胞種 ベクター 色 蛍光シグナル 測定方法 商品コード
Plate Imaging
cAMP Gs CMV Non-neuronal / whole cell Big Sky BacMam Green Upward ● ● U0250G
Downward ● ● D0250G
Red Upward ● ● U0250R
Non-neuronal / primary-cilia BacMam Green Downward - ● D0201G
Gi Non-neuronal / whole cell Big Sky BacMam Green Downward ● ● X0250G
Ca2+ Gq CMV Non-neuronal / whole cell Big Sky BacMam Green Upward ● ● U0650G
Red ● ● U0650R

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お問い合わせ先

（テクニカルサポート 試薬担当）

reagent@funakoshi.co.jp

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