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生細胞のcAMP検出用蛍光バイオセンサー cADDis cAMP BacMam Assay

掲載日情報:2017/04/06 現在Webページ番号:64420

cADDis cAMP sensor BacMamは,cAMPと特異的に結合することにより蛍光強度が上昇または減衰する蛍光タンパク質を応用した蛍光バイオセンサーです。この蛍光バイオセンサーは,蛍光プレートリーダーまたは蛍光顕微鏡による画像解析システムを用いて,従来困難であった生細胞におけるcAMPの動的挙動の継時測定,局在性の観察およびマルチプレックスアッセイを簡便に行うことができます。

cADDis cAMP sensorを導入したHEK293細胞 cADDis cAMP sensorを導入した心筋細胞
ライブセルアッセイプロトコール1 ライブセルアッセイプロトコール2

MEMO

cADDis cAMP BacMam Assay とは


ELISA法に代表される従来のcAMPの測定法は,細胞溶解など煩雑な操作が必要で,またエンドポイント測定のために生細胞における動的挙動について理解を得ることは困難でした。cAMP BacMam Assayでは,哺乳動物の生細胞において,cAMPに結合して蛍光が増大(Upward Kit)または減少(Downward Kit)する蛍光タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを使用しています。これらの発現ベクターは非増殖バキュロウイルスとして供給され,標的培養細胞に感染することにより発現しcAMPと結合することにより,一過性のcAMP感応性蛍光バイオセンサーとして機能します。
cAMPはGPCRシグナリング(Gsシグナリング)のセカンドメッセンジャーであるため,GPCRシグナリングの増幅または抑制する化合物のスクリーニングや,外部刺激に対する細胞レベルでのシグナル応答研究に最適です。

Upward sensor Downward sensor


蛍光バイオセンサー製品の種類

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Target factor 標的経路 プロモーター 細胞種 蛍光シグナル 測定方法 商品コード
Plate Imaging
cAMP Gs CMV Non-neuronal / whole cell Green Upward U0200G
Downward D0200G
Red Upward U0200R
Non-neuronal / primary-cilia Green Downward D0201G
Synapsin* Neuron / whole cell Green Upward U0202G
Downward D0202G
cAMP Gi CMV Non-neuronal / whole cell Green Upward X0200G
DAG Gq CMV Non-neuronal / whole cell Green Upward U0300G
Downward D0300G
Red Upward U0300R
Downward D0300R
PIP2 Gq CMV Non-neuronal / whole cell Green Upward D0400G
Red D0400R
Ca2+ Gq CMV Non-neuronal / whole cell Red Upward U0600R
Voltage - CMV Non-neuronal / whole cell Green Upward U0700G
Synapsin* Neuron / whole cell U0701G
Cellular stress Endoplasmic Reticulum (ER) and ER Unfolded Protein Response CMV HEK293 cells
(Adherent cells and iPSC-derived lines)
Green Upword Cell Stress Sensor Upward U0900G
Green Upword Cell Stress Sensor with constitutive red fluorescent protein for ratiometric measurement. U0901G

Synapsinプロモーターを用いた蛍光バイオセンサーは,神経細胞に特異的に感染して発現されますが,発現量が少ないために一般の蛍光プレートリーダーによる測定は困難でありお勧めしません。神経細胞で蛍光プレートリーダーを用いて解析を行う必要がある場合には,高発現が可能なCMVプロモーターの製品をご使用下さい。ただし,CMVプロモーターの蛍光バイオセンサーは神経細胞に対する特異性がないために,同じ神経系を構成するグリア細胞においても発現することにご留意下さい。

■トライアルキット

各センサーのトライアルキットです。

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商品コード製品名目的キット内容
E0200GGreen cADDis cAMP
Trial kit
緑色UpwardDownwardの選択#D0200Gと#U0200Gを
それぞれ100 assayずつ含む。
E0200RUpward cADDis cAMP
Trial kit
Upwardタイプでを選択#U0200Gと#U0200Rを
それぞれ100 assayずつ含む。
EX200GGreen Gi cADDis cAMP
Trial kit
X0200Gの小包装サイズ#X0200Gを200 assay含む。


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特長

  • 安定性の高い蛍光により,哺乳動物細胞または神経細胞内におけるcAMPの継時変化の測定が行えます。
  • 添加するバキュロウイルス量に応じて,センサー発現量を簡単に調節することが可能です。
  • 自動蛍光プレートリーダーおよびイメージングシステムに対応しています。
  • 哺乳動物生細胞(CMVプロモーター)および神経細胞(Synapsinプロモーター)を標的としたスクリーニングが可能です。
  • 簡便なシングルステップアッセイです。補酵素や細胞溶解の操作は不要です。
  • 異なる蛍光センサー製品を組み合わせて用いることにより,Gs, GqおよびGiの複数のシグナル伝達経路の多重測定を簡便に行うことができます。
  • 多くの細胞株,初代培養細胞に用いることができます。 ⇒ 使用実績のある細胞種
  • 測定回数:4×96 wellプレート分の試薬が含まれています。
  • 測定波長
蛍光色素の種類 励起波長(nm) 測定波長(nm)
Green 450~490 510~550
Red 550~590 600~700
cAMPProduction with cADDis

上図:cADDisの模式図 (Downward型センサー#D0200Gの場合)。Downward型cADDis cAMP センサーはcAMPに結合していない場合緑色蛍光を発する。Gs型GPCRであるb2-ARのアゴニストisoproterenolを添加すると,b2-AR に結合したGsが活性化され,Adenylyl cyclaseに作用し,cAMPが産生される。cAMPの産生に伴い,cADDis cAMPセンサーがcAMPに反応して,蛍光が消光する。

中図:実際にHEK293細胞でDownward型cADDis cAMPセンサーを発現させたときの細胞の蛍光観察像。

下図:蛍光像の変化を蛍光プレートリーダーで測定。縦軸(Delta F/F0)は各時間における蛍光強度Fをt=0における蛍光強度F0で割った値の変化量。

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画像解析におけるcADDis cAMP BacMam Assayの種類の選択基準

Upward Kitを利用した場合にはcAMP分子の局在と蛍光シグナルが同調するため,cAMPの局在性を直接観察することができます。しかし,もともとの蛍光バックグラウンドが高い場合では,蛍光シグナルの増幅の確認が困難になるためにDownward Kitの使用をご検討下さい。Downward Kitを使用した場合,cAMP分子の局在に対応して蛍光シグナルが消光することから,もともとの蛍光バックグラウンドが高くUpward Kitでの解析が困難な場合に有効です。この場合,細胞全体の蛍光シグナルの初期値から差分を取った減衰値によりcAMPの局在性の解析を行うことが可能です。

センサーの種類 蛍光シグナル 用途・選択基準
Upward Kit 上昇 蛍光バックグラウンドが低い場合に使用可能
Downward Kit 減衰 蛍光バックグラウンドが高い場合に有用


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使用例

(1) Isoproterenol誘導cAMP産生: カイネティック分析, 量依存的応答曲線とアッセイ信頼性解析

cAMPProduction with cADDis

A:HEK293細胞にDownward 型cADDis cAMP センサー(#D0200G)を発現させ,isoproterenolを各濃度で添加した際の蛍光強度の変化を経時的にプロットした。Isoproterenolの濃度依存的に蛍光強度の変化が見られた。

B:AのデータをもとにIsoproterenol濃度と蛍光強度の変化をプロットした。

C:再現性の評価とハイスループットスクリーニングにおける信頼性の指標であるZ’factorの算出。Z’ factor=0.95

(2) 2種類の蛍光バイオセンサーを用いたGs/Gqシグナル伝達経路特異的応答の同時測定

Gs/Gqシグナル伝達経路特異的応答の同時測定

(3) Giシグナル: カイネティック分析, 量依存的応答曲線とアッセイ信頼性解析

Ca2+/cAMPのマルチプレックス測定

A:HEK293細胞にUpward 型cADDis cAMP センサー(#X0200G)とGi型のGPCRであるドーパミンD2受容体を共発現させ,Quinpiroleを各濃度で添加した際の蛍光強度の変化をプロットした。Quinpiroleの濃度依存的に蛍光強度の変化が見られた。

B:AのデータをもとにQuinpirole濃度と蛍光強度の変化をプロットした。

C:再現性の評価とハイスループットスクリーニングにおける信頼性の指標であるZ’ factorの算出。Z’ factor=0.85

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操作方法概要

cADDis cAMP BacMam Assayの操作方法概要
  1. 細胞を播種する。
  2. BacMam(ウイルス)と添付のSodium butyrate(HDAC阻害剤)を培地に混ぜて細胞に添加する。
  3. 6時間後に培地交換し18時間培養する。
  4. センサータンパク質が発現する。
  5. 任意のアゴニスト/化合物を添加する。
  6. 蛍光プレートリーダー または蛍光顕微鏡で継時的に測定および観察を行う。

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キット内容

  • cADDis cAMP sensor BacMam (9×105~2×107 IU/ml in TNM-FH Insect Culture)*
  • Sodium butyrate aqueous solution (HDAC inhibitor)*2
  • β2 Adrenergic receptor with nuclear red label (Gs-coupled receptor as a positive control) (#X0200R以外)
  • hM2 receptor (#X0200Rのみ)
  • Isoproterenol (Gs signaling positive control)
  • Carbochol (#X0200R)

*1:キットにより内容が異なります。
*2:他のHDAC阻害物質もご使用いただけます。
測定には,96 wellマイクロプレート,蛍光プレートリーダーまたは蛍光顕微鏡(蛍光イメージングシステム)が必要です。

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他社cAMPライブセルモニタリングシステムとの比較

ポイント MOM社cADDis cAMP BacMam Assay A社ライブセルイメージングシステム
センサータンパク質 cAMP結合タンパク質融合蛍光タンパク質
cAMPにより蛍光強度が変化
cAMP結合タンパク質融合ルシフェラーゼ
cAMPによりルシフェラーゼが活性化
検出系 蛍光シグナル
- 蛍光プレートリーダー
- 各種蛍光顕微鏡 (細胞内局在の観察)
ルシフェリン発光ルミノメーター
遺伝子導入,標的細胞 BacMam:さまざまな細胞で高発現 プラスミド:細胞種が限定
薬剤応答濃度限界 nM sub-uM
アゴニスト添加後の
データサンプリング
秒単位 分単位
マルチプレックス 対応 非対応


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価格

[在庫・価格 :2019年06月24日 23時07分現在]

※ 納期として表示している期間は弊社発注日からの「目安」となり、納期を保証する物ではございません。実際には長くかかる場合もございます。ご注意ください。
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Green Downward cAMP in BacMam(5mL)

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  • 在庫:無(未発注)
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説明文 一次繊毛において,cAMPと特異的に結合することにより蛍光強度が減衰する蛍光バイオセンサー。蛍光プレートリーダーまたは蛍光顕微鏡を用いた画像解析により,一次繊毛におけるcAMPの動的挙動を簡便かつ継時的に測定することができる。測定波長:励起 450~490 nm,蛍光 510~550 nm。 ※ウイルスベクター関連製品のため,購入時に使用者確認書が必要です。
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説明文 神経細胞内で,cAMPと特異的に結合することにより蛍光強度が減衰する蛍光バイオセンサー。蛍光プレートリーダーまたは蛍光顕微鏡を用いた画像解析により,神経細胞におけるcAMPの動的挙動を簡便かつ継時的に測定することができる。測定波長:励起 450~490 nm,蛍光 510~550 nm。 ※ウイルスベクター関連製品のため,購入時に使用者確認書が必要です。
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Green Upward cAMP in BacMam(60mL)

文献数:0

  • 商品コード:U0200G
  • メーカー:MOM
  • 包装:1kit
  • 価格:¥490,000
  • 在庫:無(未発注)
  • 納期:2週間程度 
  • 法規制等:カルタヘナ該当品

説明文 哺乳動物細胞内で,cAMPと特異的に結合することにより蛍光強度が上昇する蛍光バイオセンサー。蛍光プレートリーダーまたは蛍光顕微鏡を用いた画像解析により,生細胞におけるcAMPの動的挙動を簡便かつ継時的に測定することができる。測定波長:励起 450~490 nm,蛍光 510~550 nm。 ※ウイルスベクター関連製品のため,購入時に使用者確認書が必要です。
法規制等 カルタヘナ該当品
保存条件 法規備考
掲載カタログ

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Synapsin promoter Green Upward cAMP in BacMam(1200 assay)

文献数:0

  • 商品コード:U0202G
  • メーカー:MOM
  • 包装:1kit
  • 価格:ご照会ください
  • 在庫:無(未発注)
  • 納期:2週間程度 
  • 法規制等:カルタヘナ該当品

説明文 神経細胞内で,cAMPと特異的に結合することにより蛍光強度が上昇する蛍光バイオセンサー。蛍光プレートリーダーまたは蛍光顕微鏡を用いた画像解析により,神経細胞におけるcAMPの動的挙動を簡便かつ継時的に測定することができる。測定波長:励起 450~490 nm,蛍光 510~550 nm。 ※ウイルスベクター関連製品のため,購入時に使用者確認書が必要です。
法規制等 カルタヘナ該当品
保存条件 -80℃,暗所保存 法規備考
掲載カタログ

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Red Upward cAMP in BacMam(5mL)

文献数:0

  • 商品コード:U0200R
  • メーカー:MOM
  • 包装:1kit
  • 本製品は取扱中止になりました

説明文
法規制等 カルタヘナ該当品
保存条件 法規備考
掲載カタログ

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中止

Red Upward cAMP in BacMam(400 assay, 10mL)

文献数:0

  • 商品コード:U0200R
  • メーカー:MOM
  • 包装:1kit
  • 価格:¥131,000
  • 在庫:無(未発注)
  • 納期:2週間程度 
  • 法規制等:カルタヘナ該当品

説明文 哺乳動物細胞内で,cAMPと特異的に結合することにより蛍光強度が上昇する蛍光バイオセンサー。蛍光プレートリーダーまたは蛍光顕微鏡を用いた画像解析により,生細胞におけるcAMPの動的挙動を簡便かつ継時的に測定することができる。測定波長:励起 550~590 nm,蛍光 600~700 nm。 ※ウイルスベクター関連製品のため,購入時に使用者確認書が必要です。
法規制等 カルタヘナ該当品
保存条件 4℃,暗所保存 法規備考
掲載カタログ ニュース2017年8月1日号 p.7

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Red Upward cAMP in BacMam(30mL)

文献数:0

  • 商品コード:U0200R
  • メーカー:MOM
  • 包装:1kit
  • 価格:¥314,000
  • 在庫:無(未発注)
  • 納期:2週間程度 
  • 法規制等:カルタヘナ該当品

説明文 哺乳動物細胞内で,cAMPと特異的に結合することにより蛍光強度が上昇する蛍光バイオセンサー。蛍光プレートリーダーまたは蛍光顕微鏡を用いた画像解析により,生細胞におけるcAMPの動的挙動を簡便かつ継時的に測定することができる。測定波長:励起 550~590 nm,蛍光 600~700 nm。 ※ウイルスベクター関連製品のため,購入時に使用者確認書が必要です。
法規制等 カルタヘナ該当品
保存条件 法規備考
掲載カタログ

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Red Upward cAMP in BacMam(60mL)

文献数:0

  • 商品コード:U0200R
  • メーカー:MOM
  • 包装:1kit
  • 価格:¥490,000
  • 在庫:無(未発注)
  • 納期:2週間程度 
  • 法規制等:カルタヘナ該当品

説明文 哺乳動物細胞内で,cAMPと特異的に結合することにより蛍光強度が上昇する蛍光バイオセンサー。蛍光プレートリーダーまたは蛍光顕微鏡を用いた画像解析により,生細胞におけるcAMPの動的挙動を簡便かつ継時的に測定することができる。測定波長:励起 550~590 nm,蛍光 600~700 nm。 ※ウイルスベクター関連製品のため,購入時に使用者確認書が必要です。
法規制等 カルタヘナ該当品
保存条件 法規備考
掲載カタログ

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Green cADDis Gi Assay(5mL)

文献数:0

  • 商品コード:X0200G
  • メーカー:MOM
  • 包装:1kit
  • 本製品は取扱中止になりました

説明文
法規制等 カルタヘナ該当品
保存条件 法規備考
掲載カタログ

製品記事
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中止

Green cADDis Gi Assay(400 assay, 10mL)

文献数:0

  • 商品コード:X0200G
  • メーカー:MOM
  • 包装:1kit
  • 価格:¥131,000
  • 在庫:無(未発注)
  • 納期:2週間程度 
  • 法規制等:カルタヘナ該当品

説明文 哺乳動物細胞内で,cAMPと特異的に結合することにより蛍光強度が減衰する蛍光バイオセンサー。蛍光プレートリーダーまたは蛍光顕微鏡を用いた画像解析により,生細胞におけるcAMPの動的挙動を簡便かつ継時的に測定することができる。測定波長:励起 450~490 nm,蛍光 510~550 nm。 ※ウイルスベクター関連製品のため,購入時に使用者確認書が必要です。
法規制等 カルタヘナ該当品
保存条件 4℃,暗所保存 法規備考
掲載カタログ ニュース2017年11月1日号 p.19

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Green cADDis Gi Assay(30mL)

文献数:0

  • 商品コード:X0200G
  • メーカー:MOM
  • 包装:1kit
  • 価格:¥314,000
  • 在庫:無(未発注)
  • 納期:2週間程度 
  • 法規制等:カルタヘナ該当品

説明文 哺乳動物細胞内で,cAMPと特異的に結合することにより蛍光強度が減衰する蛍光バイオセンサー。蛍光プレートリーダーまたは蛍光顕微鏡を用いた画像解析により,生細胞におけるcAMPの動的挙動を簡便かつ継時的に測定することができる。測定波長:励起 450~490 nm,蛍光 510~550 nm。 ※ウイルスベクター関連製品のため,購入時に使用者確認書が必要です。
法規制等 カルタヘナ該当品
保存条件 法規備考
掲載カタログ

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Green cADDis Gi Assay(60mL)

文献数:0

  • 商品コード:X0200G
  • メーカー:MOM
  • 包装:1kit
  • 価格:¥490,000
  • 在庫:無(未発注)
  • 納期:2週間程度 
  • 法規制等:カルタヘナ該当品

説明文 哺乳動物細胞内で,cAMPと特異的に結合することにより蛍光強度が減衰する蛍光バイオセンサー。蛍光プレートリーダーまたは蛍光顕微鏡を用いた画像解析により,生細胞におけるcAMPの動的挙動を簡便かつ継時的に測定することができる。測定波長:励起 450~490 nm,蛍光 510~550 nm。 ※ウイルスベクター関連製品のため,購入時に使用者確認書が必要です。
法規制等 カルタヘナ該当品
保存条件 法規備考
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■トライアルキット MOM402060,MOM402070,MOM422060

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(テクニカルサポート 試薬担当)

reagent@funakoshi.co.jp

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