構築用ELISA Kit DuoSet Kit

・ELISA microtiter plate（R&D Systems 社 #DY990, Costar 社 #2592 または同等の製品）

・Disposable plate sealer（R&D Systems 社 #DY992, Costar 社 #3095 または同等の製品）

・Disposable reagent reservoir

・Assorted graduated cylinder

・Wash bottle and / or automatic plate washer

・Assorted adjustable volume pipette

・8 or 12 channel multichannel pipette

・Pipette tip

・Assorted volume pipette

・Polypropylene tube（R&D Systems 社 #DY990 など）

・ELISA plate reader with optional data reduction software

・Wash buffer（R&D Systems 社 #WA126 または0.05% Tween-20 in PBS, pH 7.4）

・Diluent（R&D Systems 社 #DY004, #DY995, #DY997 など：各抗体のプロトコルを参照）

・Detection system（例：Streptavidin-HRP（R&D Systems 社 #DY998）、Color Reagent A（H₂O₂ ）and Color Reagent B（TMB）（R&D Systems 社 #DY999））

・Stop solution（R&D Systems 社 #DY994 など：検出系に基づく）

※ 製品によってプロトコルが若干異なる場合があります。必ず、製品に添付されているデータシートをご確認下さい。

1 . 1 ウェル当たり100 μl の捕捉用抗体をELISA プレートに添加して下さい（PBS で適切な濃度に希釈した抗体は、希釈後すぐに使用して下さい）。プレートをシールし、室温で一晩インキュベーションして下さい。

2 . 各ウェルの抗体溶液を吸引し、400 μl のWash buffer で洗浄して下さい。この洗浄操作は最低3 回行って下さい。洗浄用ボトル、マルチチャネルピペット、マニフォールドディスペンサーまたはオートウォッシャーを用いて、Wash buffer を各ウェルに十分に満たして下さい。正確な結果を得るために、洗浄に用いた試薬を完全に除去することが重要です。最後の洗浄の後、ウェル内に残っているWash buffer を吸引し、さらにプレートを逆さにして、ペーパータオルの上で叩いて除去して下さい。

3 . 推奨のBlocking buffer 300 μl （詳細は製品添付のデータシートをご覧下さい）を各ウェルに加え、プレートのブロッキングを行って下さい。室温で最低1 時間インキュベーションして下さい。

4 . 2 . と同様の吸引／洗浄を行って下さい。これらの操作を経て、プレートに試料を添加する準備が整ったことになります。

1 . 濃度未知の試料およびスタンダードの希釈は、ポリプロピレンチューブで行って下さい。適切な希釈液で希釈した試料またはスタンダー ド100 μ l を各ウェルに添加して下さい。プレートのフレームを軽く叩き、1 分間混合して下さい。プレートシーラーでウェルをカバーし、室温で2 時間インキュベートして下さい。

2 .「 プレートの準備」の2 . と同様の吸引／洗浄を行って下さい。

3 . 適切な希釈液で希釈したビオチン標識検出用抗体100 μl を、各ウェルに添加して下さい。新しいプレートシーラーでウェルをカバーし、室温で2 時間インキュベートして下さい。

4 .「 プレートの準備」の2 . と同様の吸引／洗浄を行って下さい。

5 . Streptavidin-HRP（R&D Systems 社 #DY998：バイアルのラベルの指示に従って希釈したもの）100 μl を各ウェルに添加して下さい。

6 .「 プレートの準備」の2 . と同様の吸引／洗浄を行って下さい。

7 . Substrate solution（R&D Systems 社 #DY999）100 μl を各ウェルに添加して下さい。室温で20 ～ 30 分間インキュベートして下さい。プレートを遮光して下さい。

8 . Stop solution 50 μl を各ウェルに添加して下さい。プレートを軽く叩き、試薬を十分に混合して下さい。

9 . 30 分以内に各ウェルの吸光度（O.D.）を測定して下さい。Substrate solution またはTMB を使用している場合は、プレートリーダーを450 nm に設定して下さい。プレートリーダーにて自動的に補正が可能な場合は、補正用の波長を540 nm または570 nm に設定して下さい。自動的にできない場合は、450 nm の測定値から540 nm または570 nm の測定値を差し引いて補正値として下さい。補正をせずに450 nm の測定値を用いると、実際よりも高い値となり、正確さを欠くことがあります。

抗体濃度 ：捕捉用抗体および検出用抗体の最適濃度を決める最良の方法は、“格子実験”です。格子実験とは、1 枚のプレート内で様々な濃度の抗体のペアを用い、使用に最適な濃度を決める方法です。この実験に用いる抗体濃度は、各抗体の種類（モノクローナルまたはポリクローナル）によって異なります。表1 は、最初の条件検討を行う際に推奨される濃度条件です。

表1：最初の条件検討に推奨される抗体濃度条件

各抗体の濃度条件に基づいて、96 ウェルプレートを図1 のように4 等分します。

図1：格子実験における捕捉用モノクローナル抗体と検出用ポリクローナル抗体の濃度条件

数多くの濃度条件の組み合わせから、最良のS/N 比を選択します。ゼロスタンダードから、各抗体濃度のペアで “ノイズ”すなわちバックグラウンド値を知ることができます。1,000、2,000 および4,000 pg/ml のスタンダードから、各抗体濃度のペアで“シグナル”の値を知ることができます。これらの結果から、バックグラウンドの値を許容でき、かつ最大のS/N 比を有した条件を選択できます。S/N 比は10 が望ましいですが、最低でも5 以上は必要です。

バックグラウンド ：吸光度（O.D.）0.2 未満が望ましいです。バックグラウンドに影響する因子としては、ブロッキング試薬、捕捉用および検出用抗体の濃度、検出系、インキュベーション時間、希釈液、洗浄の操作などがあげられます。

標準曲線の値の最高値 ：吸光度（O.D.）1.0 以上が望ましく、通常は1.0 ～ 3.0 です。標準曲線の値に影響する因子としては、捕捉用および検出用抗体の濃度（図1 の格子実験参照）、インキュベーション時間および温度、検出系に用いる基質などの濃度、抗体と抗原の親和性、pH、希釈液およびプレートリーダーの品質があげられます。

検出系 ：アッセイの感度は、検出試薬の濃度または検出系を検討することで改善できることがあります。ただし、条件によってはバックグラウンドが高くなる場合があります。

血清および血漿試料の希釈 ：血清および血漿試料は、マトリックス効果を排除するために、適切なバッファーを用いて2 倍以上希釈することが必要な場合があります。直線的な結果を得るために必要な試料の希釈系列を、あらかじめ検討し、決定して下さい。試料を希釈する際には、スタンダードに用いたのと同じ希釈液を使用します。また、希釈した試料を用いる場合は、希釈倍率をかけて値を算出します。

BSA ：ウシ血清アルブミン（BSA）は、ブロッキングおよびキャリアータンパク質として用います。BSA は等級によってはバックグラウンドが高くなるため、ELISA グレードのBSA を選択する必要があります。 インキュベーション温度： 試料および検出用抗体のインキュベーションは、室温で行います。試料を冷蔵で一晩または37℃で1 時間インキュベートした場合は、感度が高くなることがありますが、同時にバックグラウンドも上昇することがあります。

インキュベーション時間 ：室温でのインキュベーション時間を長くすることで、感度を上げることが可能です。ただし、標準曲線が平らになってしまって使用できなくなり、測定範囲が限定されてしまう可能性があることに留意して下さい。また、インキュベーション時間を長くすることでバックグラウンドも上昇することがあります。

干渉物質 ：異好性抗体やリウマチ因子のような干渉物質の存在に注意することは重要です。これらの因子の制御方法については、“The Immunoassay Handbook Third Edition”（David Geoffrey Wild 編、Nature Publishing Group, 2001）をご参照下さい。

試薬の再構成および保存条件 ：試薬を適切に作用させるためには、必ず各試薬の説明書に従って再構成および保存を行って下さい。

試料の準備および保存 ：すべての試料が同一の安定性を有しているとは限らないため、取り扱いには注意が必要です。試料は調製後、ただちに一回使い切りの容量に分注して－ 70℃で保管する必要があります。試料の種類によっては自動霜取機能のないフリーザーで－20℃に保管することも可能です。キャリアータンパク質を含んでいる試料が、最も望ましい状態です。凍結／融解の繰り返しは避けて下さい。

試料／スタンダードの量 ：試料／スタンダードの量を増やす（例：100 μ l → 200 μ l）ことで、感度を上げることが可能です。

基質 ：基質には様々な種類がありますが、中には十分な値を得るために長時間のインキュベーションが必要となる基質もあります。一般的には、基質に異常がなければ、インキュベーション時間を長くすることで感度を上げることが可能です。また、バックグラウンドが高くなりすぎないよう開発されたプレートであるかを確認して下さい。一般的なインキュベーション時間は、10 ～ 30 分です。基質の測定波長に対応したフィルターを使用して下さい。

シェーカーの使用 ：室温でのシェーカー使用で感度を上げることができます。インキュベーション時間は検討して下さい。 洗浄 ：ELISA プロトコルの洗浄操作（p.4「プレートの準備」 2. ）をご参照下さい。不十分な洗浄は、高い分散係数やバックグラウンドをもたらし、不正確な値を得る原因になります。

感度： 感度は使用する抗体のペアによって様々です。感度に影響する因子としては、捕捉用および検出用抗体の濃度（図1 の格子実験参照）、インキュベーション時間および温度、抗体と抗原の親和性、試料／スタンダードの量、pH、希釈液および洗浄バッファーの組成があげられます。ただし、各抗体ペアが到達できる感度には限界があります。

R&D Systems(R&Dシステムズ)社 ELISA 添加回収試験（Spike and Recovery Test）プロトコルのpdf版ダウンロードはこちら

・R&D Systems社Quantikine ELISA Kitはこちら。

ELISA は、対象因子を特異的に認識する抗体を用いて、試料中の対象因子を相対定量する測定法です。しかし、試料中または希釈溶液中に含まれる測定干渉物質（BSA、補体、異好性抗体、リウマチ因子など）により、抗原抗体反応が阻害され、測定精度に影響を及ぼし、実際の対象因子の含有量と測定値との間に“ずれ”が生じることがあります。
R&D Systems(R&Dシステムズ)社（以下RSD 社）では、各ELISA キットについて、測定干渉物質による“ずれ”が生じないことを確認するために、「添加回収試験（Spike and Recovery Test）」ならびに「直線性試験（Linearity Test）」を実施しています。両試験を実施し、測定に問題がないことが確認されている試料を「適用試料」、それ以外の試料を「適用外試料」としています。
適用外試料を用いて測定を行いたい場合、測定を開始する前に、お客様ご自身で添加回収試験と直線性試験を実施し、ご使用になるキットがその試料の測定に適しているかどうかを確認する必要があります。

添加回収試験（Spike and Recovery Test）：
試料溶液に濃度既知の対象因子を添加（Spike）し、その添加量が測定値に正しく反映されるか（回収（Recovery））を確認する試験です。試料に含まれる成分による干渉の有無がわかります。

直線性試験（Linearity Test）：
濃度既知の対象因子を添加した試料と添加しなかった試料で希釈系列を作製・測定し、直線性（Lineality）を確認する試験です。測定値が直線性を示さなかった場合には、試料に含まれる成分の干渉により、正確な測定が妨げられていることがわかります。さらに、直線性を示す希釈範囲を決定することも重要です。
本項では添加回収試験と直線性試験のプロトコル例をご紹介します。

＊1 標準曲線範囲に収まるよう、希釈して使用。

キット付属のスタンダードに、ELISA キットのプロトコル上でスタンダード調製の際に指定されている量の1/10 量の希釈溶液^＊2を加え、10 × Spiking Stock Soluion とします。
例） ELISA キットのプロトコル上で「Calibirator Diluent を5 ml 加えて200 pg/ml のスタンダードストック溶液とする。」と記載されている場合。
→ Calibirator Diluent を0.5 ml 加えて2 ng/ml の10 × Spiking Stock Solution とする。

10 × Spiking Stock Solution に適切な希釈溶液^＊2を加えて10 倍希釈後、キット付属のプロトコルに従い、スタンダードの系列希釈を行う。
＊2 Spiking Stock Solution の調製と希釈に用いる溶液は、ELISA キットのプロトコルを参照し、適切なものを使用して下さい。

以下の手順に従って、試料（添加なし／あり）とコントロール（添加あり）を調製して下さい。

1. チューブを3 本用意し、それぞれに「試料（添加なし）」、「試料（添加あり）」、「コントロール（添加あり）」と書いたラベルを貼る。

2. 試料（2.0 ml）を良く混合し、下記のように加える。
（a）：「試料（添加なし）」チューブに試料を1.0 ml 加える。→このまま測定に使用する。
（b）：「試料（添加あり）」チューブに試料を1.0 ml 加える。

3. 「 コントロール（添加あり）」のチューブに希釈溶液＊ 2 を1.0 ml 加える（c）。

4. 新たにチューブを用意し、「試料（添加あり）」、「コントロール（添加あり）」に10 × Spiking Stock Solution をそれぞれ同量添加して測定用試料を調製する^＊3。10 × Spiking Stock Solution 由来の標準物質の濃度が、標準曲線の中間程度の値になるよう添加量を調節する。最終容量が二重測定に十分な量になるよう調節する。
例） （d）：「試料（添加あり）」980 μ l に10 × Spiking Stock Solution を20 μ l 添加する。
（e）：「コントロール（添加あり）」980 μ l に10 × Spiking Stock Solution を20 μ l 添加する。

5. 調製した試料およびコントロールをボルテックスで混合する。

＊2 Spiking Stock Solution の調製と希釈に用いる溶液は、ELISA キットのプロトコルを参照し、適切なものを使用して下さい。
＊3 調製は、同じピペットを用いて同時に行う必要がありますが、ピペットチップはその都度交換して下さい。

直線性試験を行うため、（d）「試料（添加あり）」と（e）「コントロール（添加あり）」の希釈系列を作製します。（a）「試料（添加なし）」の濃度がスタンダードの最高濃度の60％を超えている場合には、同様に希釈系列を作製して測定を行って下さい。
系列希釈した試料の測定値が、キットの標準曲線と同様の傾きを示すかどうかを確認することで、試料を希釈しても測定値の正確性が保たれるかを判断できます。

1. 1：2 希釈
（a）「試料（添加なし）」、（d）「試料（添加あり）」、（e）「コントロール（添加あり）」それぞれ0.5 ml に希釈溶液0.5 ml を加える。

2. 1：4 希釈
上記の1：2 希釈した各試料溶液0.5 ml にさらに希釈溶液0.5 ml を加える。

3. 1：8 希釈
上記の1：4 希釈した各試料溶液0.5 ml にさらに希釈溶液0.5 ml を加える。

※ 希釈するたびにボルテックスで混合して下さい。

キット付属のプロトコルに従い、III、IV、Vで調製した試料を用いてアッセイを行います。

プレートのウェル配置図

以下の計算式を使用して、測定値を算出し、解析を行います。

1. 添加回収試験

2. 直線性試験

・「 試料（添加あり）」の直線性を検討する場合、「試料（添加あり）」の測定値を「予測値」とする。

・「 試料（添加なし）」の直線性を検討する場合、「試料（添加なし）」の測定値を「予測値」とする。

※ 回収率80 ～ 120％が許容範囲です。

※「 コントロール（添加あり）」は希釈系列が正しく作製できているかの確認に使用します。「コントロール（添加あり）」の回収率が80 ～120％にならない場合は、調製方法に問題があると考えられます。

添加回収試験および直線性試験の測定値が適切な範囲内に収まっていれば、条件未検討の適用外試料にELISA キットを使用する際の信頼度が向上します。

・R&D Systems社Quantikine ELISA Kitはこちら。

Q 精度が低い

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Q 標準曲線が描けない

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Q 標準曲線のOD 値が全体的に低い。または、標準曲線の傾きが小さい

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Q 十分なシグナル強度が得られない

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Q バックグラウンドが高い

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Q 測定の再現性が悪い

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Q 試料中に測定物質が検出されない

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Q 試料の吸光度が標準曲線の測定範囲を超えてしまった

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Q プレートすべてのウェルで吸光度が低い

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Qプレートすべてのウェルで吸光度が高い

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Q 誤差