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構築用ELISA Kit DuoSet Kit

掲載日情報:2017/02/13 現在Webページ番号:81004

DuoSet Kitは,組換え型サイトカインやケモカイン,成長因子,プロテアーゼサンドイッチELISA によるアッセイ系を,お客様自身で組み立てるシステムです。

DuoSet Kit製品写真

特長

  • 細胞培養液などの試料中の天然型および組換え体サイトカインを測定できます。
  • 96 ウェルプレート 5または15 枚分の試薬が含まれています。
  • 基質,バッファー,抗体濃度や反応時間等を自由に組み合わせることができます。

ご使用前に抗体や Streptavidin - HRP の希釈濃度等を検討する必要があります。
抗体やスタンダードの容量、使用濃度等はメーカーウェブサイトからダウンロードできるCoAをご参照下さい。

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キット内容

  • Capture antibody
  • Standard
  • Streptavidin – HRP
  • Biotinylated detection antibody

以下のものはキットに含まれていませんので別途ご用意ください。詳細はデータシートの「OTHER MATERIALS & SOLUTIONS REQUIRED」をご参照下さい。

  • 96 well microplates
  • Plate Sealers
  • PBS
  • Wash Buffer
  • Reagent Diluent
  • Substrate Solution
  • Stop Solution

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その他別売品(DuoSet Ancillary Reagent Kit)

DuoSet Ancillary Reagent Kitは,DuoSet Kitシリーズ5枚分構築するのに必要なプレート,基質,バッファー類をセットにしたキットです。DuoSet Kitの種類によって対応するReagent Kit(1,2,3)が異なります。DuoSet Kitのデータシートでご確認下さい。

[在庫・価格 :2020年11月27日 13時51分現在]

※ 表示されている納期は弊社に在庫が無く、取り寄せた場合の納期目安となります。
詳細 商品名
  • 商品コード
  • メーカー
  • 包装
  • 価格
  • 在庫
  • 法規制等
納期 文献数
DuoSet Ancillary Reagent Kit 1, 5 Plate
10日程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 0
説明文
DuoSet ELISA 5 plate Kit用別売品。キット内容:ELISA Plate-Coating Buffer, Reagent Diluent Concentrate 1, Reagent Diluent Concentrate 3 (5X), Stop Solution, Color Reagent A, Color Reagent B, Wash Buffer Concentrate, 20X PBS, Clear Microplates, ELISA Plate Sealers,アッセイ法:Solid Phase Sandwich ELISA,測定因子:Buffers, Chelators and Reagents
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
掲載カタログ

製品記事 DuoSetに必要な別売品セット(DuoSet Ancillary Reagent Kit)/その他別売品
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DuoSet Ancillary Reagent Kit 2, 5 Plate
10日程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 16
説明文
DuoSet ELISA 5 plate Kit用別売品。キット内容:ELISA Plate-Coating Buffer, Reagent Diluent Concentrate 2 (10X), Stop Solution, Color Reagent A, Color Reagent B, Wash Buffer Concentrate, Clear Microplates, ELISA Plate Sealers,アッセイ法:Solid Phase Sandwich ELISA,測定因子:Buffers, Chelators and Reagents
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
掲載カタログ

製品記事 DuoSetに必要な別売品セット(DuoSet Ancillary Reagent Kit)/その他別売品
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DuoSet Ancillary Reagent Kit 3, 5 Plate
10日程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 0
説明文
DuoSet ELISA 5 plate Kit用別売品。キット内容:ELISA Plate-Coating Buffer, Reagent Diluent Concentrate 3 (5X), Stop Solution, Color Reagent A, Color Reagent B, Wash Buffer Concentrate, 20X PBS, Clear Microplates, ELISA Plate Sealers,アッセイ法:Solid Phase Sandwich ELISA,測定因子:Buffers, Chelators and Reagents
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
掲載カタログ

製品記事 DuoSetに必要な別売品セット(DuoSet Ancillary Reagent Kit)/その他別売品
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[在庫・価格 :2020年11月27日 13時51分現在]

※ 表示されている納期は弊社に在庫が無く、取り寄せた場合の納期目安となります。

DuoSet Ancillary Reagent Kit 1, 5 Plate

文献数:0

説明文 DuoSet ELISA 5 plate Kit用別売品。キット内容:ELISA Plate-Coating Buffer, Reagent Diluent Concentrate 1, Reagent Diluent Concentrate 3 (5X), Stop Solution, Color Reagent A, Color Reagent B, Wash Buffer Concentrate, 20X PBS, Clear Microplates, ELISA Plate Sealers,アッセイ法:Solid Phase Sandwich ELISA,測定因子:Buffers, Chelators and Reagents
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
掲載カタログ

製品記事 DuoSetに必要な別売品セット(DuoSet Ancillary Reagent Kit)/その他別売品
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DuoSet Ancillary Reagent Kit 2, 5 Plate

文献数:16

説明文 DuoSet ELISA 5 plate Kit用別売品。キット内容:ELISA Plate-Coating Buffer, Reagent Diluent Concentrate 2 (10X), Stop Solution, Color Reagent A, Color Reagent B, Wash Buffer Concentrate, Clear Microplates, ELISA Plate Sealers,アッセイ法:Solid Phase Sandwich ELISA,測定因子:Buffers, Chelators and Reagents
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
掲載カタログ

製品記事 DuoSetに必要な別売品セット(DuoSet Ancillary Reagent Kit)/その他別売品
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DuoSet Ancillary Reagent Kit 3, 5 Plate

文献数:0

説明文 DuoSet ELISA 5 plate Kit用別売品。キット内容:ELISA Plate-Coating Buffer, Reagent Diluent Concentrate 3 (5X), Stop Solution, Color Reagent A, Color Reagent B, Wash Buffer Concentrate, 20X PBS, Clear Microplates, ELISA Plate Sealers,アッセイ法:Solid Phase Sandwich ELISA,測定因子:Buffers, Chelators and Reagents
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
掲載カタログ

製品記事 DuoSetに必要な別売品セット(DuoSet Ancillary Reagent Kit)/その他別売品
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その他別売品

[在庫・価格 :2020年11月27日 13時51分現在]

※ 表示されている納期は弊社に在庫が無く、取り寄せた場合の納期目安となります。
詳細 商品名
  • 商品コード
  • メーカー
  • 包装
  • 価格
  • 在庫
  • 法規制等
納期 文献数
Plate Sealer (100pieces)
10日程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 1
説明文
測定因子:General Laboratory Research Reagent
法規制等
保存条件 法規備考
掲載カタログ

製品記事 DuoSetに必要な別売品セット(DuoSet Ancillary Reagent Kit)/その他別売品
DuoSet IC ELISA Development System シリーズ
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Polystyrene Microplates for DuoSet, Clear (25plates)
10日程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 4
説明文
測定因子:General Laboratory Research Reagent
法規制等
保存条件 室温 法規備考
掲載カタログ

製品記事 DuoSetに必要な別売品セット(DuoSet Ancillary Reagent Kit)/その他別売品
DuoSet IC ELISA Development System シリーズ
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Quantikine Wash Buffer 1
10日程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 8
説明文
一部のQuantikine Kit用。測定因子:General Laboratory Research Reagent
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
掲載カタログ

製品記事 DuoSetに必要な別売品セット(DuoSet Ancillary Reagent Kit)/その他別売品
DuoSet IC ELISA Development System シリーズ
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Sample Diluent Concentrate 1, 5×(5×21ml)
10日程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 1
説明文
DuoSet IC用。測定因子:General Laboratory Research Reagent
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
掲載カタログ

製品記事 DuoSetに必要な別売品セット(DuoSet Ancillary Reagent Kit)/その他別売品
DuoSet IC ELISA Development System シリーズ
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Sample Diluent Concentrate 2
10日程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 3
説明文
DuoSet IC用。測定因子:General Laboratory Research Reagent
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
掲載カタログ

製品記事 DuoSetに必要な別売品セット(DuoSet Ancillary Reagent Kit)/その他別売品
DuoSet IC ELISA Development System シリーズ
関連記事
Reagent Diluent Concentrate 2, 10×
10日程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 22
説明文
一部のDuoSet用。測定因子:General Laboratory Research Reagent
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
掲載カタログ

製品記事 DuoSetに必要な別売品セット(DuoSet Ancillary Reagent Kit)/その他別売品
DuoSet IC ELISA Development System シリーズ
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Stop Solution, Sulfuric Acid, 2N (15×6 ml)
10日程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 18
説明文
DuoSet Kit用。測定因子:General Laboratory Research Reagent
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
掲載カタログ

製品記事 DuoSetに必要な別売品セット(DuoSet Ancillary Reagent Kit)/その他別売品
DuoSet IC ELISA Development System シリーズ
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Streptavidin, HRP Conjugate
10日程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 74
説明文
測定因子:General Laboratory Research Reagent
法規制等
保存条件 4℃,凍結禁止 法規備考
掲載カタログ

製品記事 DuoSetに必要な別売品セット(DuoSet Ancillary Reagent Kit)/その他別売品
DuoSet IC ELISA Development System シリーズ
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Substrate Reagent Pack
10日程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 83
説明文
DuoSet ELISA Kit用基質セット。キット内容:試薬A(Stabilized hydrogen peroxide),試薬B(Stabilized chromogen(TMB)),補助キット:DuoSet ELISA Ancillary Reagent Kit 2(#DY008),測定因子:General Laboratory Research Reagent
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
掲載カタログ

製品記事 DuoSetに必要な別売品セット(DuoSet Ancillary Reagent Kit)/その他別売品
DuoSet IC ELISA Development System シリーズ
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Sample Activation Kit 1
10日程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 1
説明文
種交差性:Multi-Species,測定因子:Buffers, Chelators and Reagents
法規制等
保存条件 室温 法規備考
掲載カタログ

製品記事 DuoSetに必要な別売品セット(DuoSet Ancillary Reagent Kit)/その他別売品
Sample Activation Kit 1
関連記事

[在庫・価格 :2020年11月27日 13時51分現在]

※ 表示されている納期は弊社に在庫が無く、取り寄せた場合の納期目安となります。

Plate Sealer (100pieces)

文献数:1

説明文 測定因子:General Laboratory Research Reagent
法規制等
保存条件 法規備考
掲載カタログ

製品記事 DuoSetに必要な別売品セット(DuoSet Ancillary Reagent Kit)/その他別売品
DuoSet IC ELISA Development System シリーズ
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Polystyrene Microplates for DuoSet, Clear (25plates)

文献数:4

説明文 測定因子:General Laboratory Research Reagent
法規制等
保存条件 室温 法規備考
掲載カタログ

製品記事 DuoSetに必要な別売品セット(DuoSet Ancillary Reagent Kit)/その他別売品
DuoSet IC ELISA Development System シリーズ
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Quantikine Wash Buffer 1

文献数:8

説明文 一部のQuantikine Kit用。測定因子:General Laboratory Research Reagent
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
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製品記事 DuoSetに必要な別売品セット(DuoSet Ancillary Reagent Kit)/その他別売品
DuoSet IC ELISA Development System シリーズ
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Sample Diluent Concentrate 1, 5×(5×21ml)

文献数:1

説明文 DuoSet IC用。測定因子:General Laboratory Research Reagent
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
掲載カタログ

製品記事 DuoSetに必要な別売品セット(DuoSet Ancillary Reagent Kit)/その他別売品
DuoSet IC ELISA Development System シリーズ
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Sample Diluent Concentrate 2

文献数:3

説明文 DuoSet IC用。測定因子:General Laboratory Research Reagent
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
掲載カタログ

製品記事 DuoSetに必要な別売品セット(DuoSet Ancillary Reagent Kit)/その他別売品
DuoSet IC ELISA Development System シリーズ
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Reagent Diluent Concentrate 2, 10×

文献数:22

説明文 一部のDuoSet用。測定因子:General Laboratory Research Reagent
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
掲載カタログ

製品記事 DuoSetに必要な別売品セット(DuoSet Ancillary Reagent Kit)/その他別売品
DuoSet IC ELISA Development System シリーズ
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Stop Solution, Sulfuric Acid, 2N (15×6 ml)

文献数:18

説明文 DuoSet Kit用。測定因子:General Laboratory Research Reagent
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
掲載カタログ

製品記事 DuoSetに必要な別売品セット(DuoSet Ancillary Reagent Kit)/その他別売品
DuoSet IC ELISA Development System シリーズ
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Streptavidin, HRP Conjugate

文献数:74

説明文 測定因子:General Laboratory Research Reagent
法規制等
保存条件 4℃,凍結禁止 法規備考
掲載カタログ

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DuoSet IC ELISA Development System シリーズ
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Substrate Reagent Pack

文献数:83

説明文 DuoSet ELISA Kit用基質セット。キット内容:試薬A(Stabilized hydrogen peroxide),試薬B(Stabilized chromogen(TMB)),補助キット:DuoSet ELISA Ancillary Reagent Kit 2(#DY008),測定因子:General Laboratory Research Reagent
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
掲載カタログ

製品記事 DuoSetに必要な別売品セット(DuoSet Ancillary Reagent Kit)/その他別売品
DuoSet IC ELISA Development System シリーズ
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Sample Activation Kit 1

文献数:1

説明文 種交差性:Multi-Species,測定因子:Buffers, Chelators and Reagents
法規制等
保存条件 室温 法規備考
掲載カタログ

製品記事 DuoSetに必要な別売品セット(DuoSet Ancillary Reagent Kit)/その他別売品
Sample Activation Kit 1
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品質について

選び抜かれた抗体ペア

Quantikine ELISA Kit Specific Detection of Recombinant and Natural Human IL-6. The detection antibody from the Human IL-6 DuoSet ELISA Development System (Catalog # DY206) was used to detect recombinant human (rh) IL-6 standard (lane 1), in human monocytes treated with Okadaic Acid (OA; lane 2), wild-type (WT) HEK293 cells (lane 3), or IL-6-transfected HEK293 cells (lane 4) by Western blotting. The detection antibody specifically recognized recombinant, natural, and exogenously expressed human IL-6.

低いロット間差


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構築ガイド

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ELISA 構築に必要な消耗品/装置

(クリックで開閉します)

・ELISA microtiter plate(R&D Systems 社 #DY990, Costar 社 #2592 または同等の製品)

・Disposable plate sealer(R&D Systems 社 #DY992, Costar 社 #3095 または同等の製品)

・Disposable reagent reservoir

・Assorted graduated cylinder

・Wash bottle and / or automatic plate washer

・Assorted adjustable volume pipette

・8 or 12 channel multichannel pipette

・Pipette tip

・Assorted volume pipette

・Polypropylene tube(R&D Systems 社 #DY990 など)

・ELISA plate reader with optional data reduction software


ELISA 構築に必要な試薬

・Wash buffer(R&D Systems 社 #WA126 または0.05% Tween-20 in PBS, pH 7.4)

・Diluent(R&D Systems 社 #DY004, #DY995, #DY997 など:各抗体のプロトコルを参照)

・Detection system(例:Streptavidin-HRP(R&D Systems 社 #DY998),Color Reagent A(H2O2 )and Color Reagent B(TMB)(R&D Systems 社 #DY999))

・Stop solution(R&D Systems 社 #DY994 など:検出系に基づく)


ELISA プロトコル

製品によってプロトコルが若干異なる場合があります。必ず,製品に添付されているデータシートをご確認下さい。


プレートの準備

1 . 1 ウェル当たり100 μl の捕捉用抗体をELISA プレートに添加して下さい(PBS で適切な濃度に希釈した抗体は,希釈後すぐに使用して下さい)。プレートをシールし,室温で一晩インキュベーションして下さい。

2 . 各ウェルの抗体溶液を吸引し,400 μl のWash buffer で洗浄して下さい。この洗浄操作は最低3 回行って下さい。洗浄用ボトル,マルチチャネルピペット,マニフォールドディスペンサーまたはオートウォッシャーを用いて,Wash buffer を各ウェルに十分に満たして下さい。正確な結果を得るために,洗浄に用いた試薬を完全に除去することが重要です。最後の洗浄の後,ウェル内に残っているWash buffer を吸引し,さらにプレートを逆さにして,ペーパータオルの上で叩いて除去して下さい。

3 . 推奨のBlocking buffer 300 μl (詳細は製品添付のデータシートをご覧下さい)を各ウェルに加え,プレートのブロッキングを行って下さい。室温で最低1 時間インキュベーションして下さい。

4 . 2 . と同様の吸引/洗浄を行って下さい。これらの操作を経て,プレートに試料を添加する準備が整ったことになります。


アッセイの手順

1 . 濃度未知の試料およびスタンダードの希釈は,ポリプロピレンチューブで行って下さい。適切な希釈液で希釈した試料またはスタンダー ド100 μ l を各ウェルに添加して下さい。プレートのフレームを軽く叩き,1 分間混合して下さい。プレートシーラーでウェルをカバーし,室温で2 時間インキュベートして下さい。

2 .「 プレートの準備」の2 . と同様の吸引/洗浄を行って下さい。

3 . 適切な希釈液で希釈したビオチン標識検出用抗体100 μl を,各ウェルに添加して下さい。新しいプレートシーラーでウェルをカバーし,室温で2 時間インキュベートして下さい。

4 .「 プレートの準備」の2 . と同様の吸引/洗浄を行って下さい。

5 . Streptavidin-HRP(R&D Systems 社 #DY998:バイアルのラベルの指示に従って希釈したもの)100 μl を各ウェルに添加して下さい。

プレートをカバーし,室温で20 分間インキュベートして下さい。HRP 以外の検出系を用いることも可能です。プレートを遮光して下さい。

6 .「 プレートの準備」の2 . と同様の吸引/洗浄を行って下さい。

7 . Substrate solution(R&D Systems 社 #DY999)100 μl を各ウェルに添加して下さい。室温で20 ~ 30 分間インキュベートして下さい。プレートを遮光して下さい。

8 . Stop solution 50 μl を各ウェルに添加して下さい。プレートを軽く叩き,試薬を十分に混合して下さい。

9 . 30 分以内に各ウェルの吸光度(O.D.)を測定して下さい。Substrate solution またはTMB を使用している場合は,プレートリーダーを450 nm に設定して下さい。プレートリーダーにて自動的に補正が可能な場合は,補正用の波長を540 nm または570 nm に設定して下さい。自動的にできない場合は,450 nm の測定値から540 nm または570 nm の測定値を差し引いて補正値として下さい。補正をせずに450 nm の測定値を用いると,実際よりも高い値となり,正確さを欠くことがあります。


アッセイの最適化

抗体濃度 :捕捉用抗体および検出用抗体の最適濃度を決める最良の方法は,“格子実験”です。格子実験とは,1 枚のプレート内で様々な濃度の抗体のペアを用い,使用に最適な濃度を決める方法です。この実験に用いる抗体濃度は,各抗体の種類(モノクローナルまたはポリクローナル)によって異なります。表1 は,最初の条件検討を行う際に推奨される濃度条件です。

捕捉用モノクローナル抗体または検出用ポリクローナル抗体の濃度
捕捉用モノクローナル抗体の濃度 1, 2, 4, 8 μg/ml 0.5, 1, 2, 4 μg/ml 0.2, 0.4, 0.8 μg/ml
検出用ポリクローナル抗体の濃度 50, 100, 200, 400 ng/ml 0.25, 0.5, 1, 2 ng/ml 50, 100, 200, 400 ng/ml

表1:最初の条件検討に推奨される抗体濃度条件

各抗体の濃度条件に基づいて,96 ウェルプレートを図1 のように4 等分します。

図1:格子実験における捕捉用モノクローナル抗体と検出用ポリクローナル抗体の濃度条件

図1:格子実験における捕捉用モノクローナル抗体と検出用ポリクローナル抗体の濃度条件


数多くの濃度条件の組み合わせから,最良のS/N 比を選択します。ゼロスタンダードから,各抗体濃度のペアで “ノイズ”すなわちバックグラウンド値を知ることができます。1,000,2,000 および4,000 pg/ml のスタンダードから,各抗体濃度のペアで“シグナル”の値を知ることができます。これらの結果から,バックグラウンドの値を許容でき,かつ最大のS/N 比を有した条件を選択できます。S/N 比は10 が望ましいですが,最低でも5 以上は必要です。


バックグラウンド :吸光度(O.D.)0.2 未満が望ましいです。バックグラウンドに影響する因子としては,ブロッキング試薬,捕捉用および検出用抗体の濃度,検出系,インキュベーション時間,希釈液,洗浄の操作などがあげられます。


標準曲線の値の最高値 :吸光度(O.D.)1.0 以上が望ましく,通常は1.0 ~ 3.0 です。標準曲線の値に影響する因子としては,捕捉用および検出用抗体の濃度(図1 の格子実験参照),インキュベーション時間および温度,検出系に用いる基質などの濃度,抗体と抗原の親和性,pH,希釈液およびプレートリーダーの品質があげられます。


検出系 :アッセイの感度は,検出試薬の濃度または検出系を検討することで改善できることがあります。ただし,条件によってはバックグラウンドが高くなる場合があります。


血清および血漿試料の希釈 :血清および血漿試料は,マトリックス効果を排除するために,適切なバッファーを用いて2 倍以上希釈することが必要な場合があります。直線的な結果を得るために必要な試料の希釈系列を,あらかじめ検討し,決定して下さい。試料を希釈する際には,スタンダードに用いたのと同じ希釈液を使用します。また,希釈した試料を用いる場合は,希釈倍率をかけて値を算出します。


BSA :ウシ血清アルブミン(BSA)は,ブロッキングおよびキャリアータンパク質として用います。BSA は等級によってはバックグラウンドが高くなるため,ELISA グレードのBSA を選択する必要があります。 インキュベーション温度: 試料および検出用抗体のインキュベーションは,室温で行います。試料を冷蔵で一晩または37℃で1 時間インキュベートした場合は,感度が高くなることがありますが,同時にバックグラウンドも上昇することがあります。


インキュベーション時間 :室温でのインキュベーション時間を長くすることで,感度を上げることが可能です。ただし,標準曲線が平らになってしまって使用できなくなり,測定範囲が限定されてしまう可能性があることに留意して下さい。また,インキュベーション時間を長くすることでバックグラウンドも上昇することがあります。


干渉物質 :異好性抗体やリウマチ因子のような干渉物質の存在に注意することは重要です。これらの因子の制御方法については,“The Immunoassay Handbook Third Edition”(David Geoffrey Wild 編,Nature Publishing Group, 2001)をご参照下さい。


試薬の再構成および保存条件 :試薬を適切に作用させるためには,必ず各試薬の説明書に従って再構成および保存を行って下さい。


試料の準備および保存 :すべての試料が同一の安定性を有しているとは限らないため,取り扱いには注意が必要です。試料は調製後,ただちに一回使い切りの容量に分注して- 70℃で保管する必要があります。試料の種類によっては自動霜取機能のないフリーザーで-20℃に保管することも可能です。キャリアータンパク質を含んでいる試料が,最も望ましい状態です。凍結/融解の繰り返しは避けて下さい。


試料/スタンダードの量 :試料/スタンダードの量を増やす(例:100 μ l → 200 μ l)ことで,感度を上げることが可能です。


基質 :基質には様々な種類がありますが,中には十分な値を得るために長時間のインキュベーションが必要となる基質もあります。一般的には,基質に異常がなければ,インキュベーション時間を長くすることで感度を上げることが可能です。また,バックグラウンドが高くなりすぎないよう開発されたプレートであるかを確認して下さい。一般的なインキュベーション時間は,10 ~ 30 分です。基質の測定波長に対応したフィルターを使用して下さい。


シェーカーの使用 :室温でのシェーカー使用で感度を上げることができます。インキュベーション時間は検討して下さい。 洗浄 :ELISA プロトコルの洗浄操作(p.4「プレートの準備」 2. )をご参照下さい。不十分な洗浄は,高い分散係数やバックグラウンドをもたらし,不正確な値を得る原因になります。

感度: 感度は使用する抗体のペアによって様々です。感度に影響する因子としては,捕捉用および検出用抗体の濃度(図1 の格子実験参照),インキュベーション時間および温度,抗体と抗原の親和性,試料/スタンダードの量,pH,希釈液および洗浄バッファーの組成があげられます。ただし,各抗体ペアが到達できる感度には限界があります。

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添加回収試験(Spike and Recovery Test)

(クリックで開閉します)

適用試料と適用外試料について

ELISA は,対象因子を特異的に認識する抗体を用いて,試料中の対象因子を相対定量する測定法です。しかし,試料中または希釈溶液中に含まれる測定干渉物質(BSA,補体,異好性抗体,リウマチ因子など)により,抗原抗体反応が阻害され,測定精度に影響を及ぼし,実際の対象因子の含有量と測定値との間に“ずれ”が生じることがあります。
R&D Systems(R&Dシステムズ)社(以下RSD 社)では,各ELISA キットについて,測定干渉物質による“ずれ”が生じないことを確認するために,「添加回収試験(Spike and Recovery Test)」ならびに「直線性試験(Linearity Test)」を実施しています。両試験を実施し,測定に問題がないことが確認されている試料を「適用試料」,それ以外の試料を「適用外試料」としています。
適用外試料を用いて測定を行いたい場合,測定を開始する前に,お客様ご自身で添加回収試験と直線性試験を実施し,ご使用になるキットがその試料の測定に適しているかどうかを確認する必要があります。


添加回収試験(Spike and Recovery Test)
試料溶液に濃度既知の対象因子を添加(Spike)し,その添加量が測定値に正しく反映されるか(回収(Recovery))を確認する試験です。試料に含まれる成分による干渉の有無がわかります。


直線性試験(Linearity Test)
濃度既知の対象因子を添加した試料と添加しなかった試料で希釈系列を作製・測定し,直線性(Lineality)を確認する試験です。測定値が直線性を示さなかった場合には,試料に含まれる成分の干渉により,正確な測定が妨げられていることがわかります。さらに,直線性を示す希釈範囲を決定することも重要です。
本項では添加回収試験と直線性試験のプロトコル例をご紹介します。


プロトコル例


I.試験に必要なもの

  • ELISA キット
  • ELISA に必要な器具(製品添付のデータシート参照)
  • 10 × Spiking Stock Solution(下記調製方法参照)
  • 試料2.0 ml(キットの標準曲線範囲内の濃度のもの)*1

*1 標準曲線範囲に収まるよう,希釈して使用。


II.Spiking Stock Solution の調製

キット付属のスタンダードに,ELISA キットのプロトコル上でスタンダード調製の際に指定されている量の1/10 量の希釈溶液*2を加え,10 × Spiking Stock Soluion とします。
例) ELISA キットのプロトコル上で「Calibirator Diluent を5 ml 加えて200 pg/ml のスタンダードストック溶液とする。」と記載されている場合。
→ Calibirator Diluent を0.5 ml 加えて2 ng/ml の10 × Spiking Stock Solution とする。


III.スタンダードの調製

10 × Spiking Stock Solution に適切な希釈溶液*2を加えて10 倍希釈後,キット付属のプロトコルに従い,スタンダードの系列希釈を行う。
*2 Spiking Stock Solution の調製と希釈に用いる溶液は,ELISA キットのプロトコルを参照し,適切なものを使用して下さい。


IV.試料およびコントロールの調製

以下の手順に従って,試料(添加なし/あり)とコントロール(添加あり)を調製して下さい。

1. チューブを3 本用意し,それぞれに「試料(添加なし)」,「試料(添加あり)」,「コントロール(添加あり)」と書いたラベルを貼る。

2. 試料(2.0 ml)を良く混合し,下記のように加える。
(a):「試料(添加なし)」チューブに試料を1.0 ml 加える。→このまま測定に使用する。
(b):「試料(添加あり)」チューブに試料を1.0 ml 加える。

3. 「 コントロール(添加あり)」のチューブに希釈溶液* 2 を1.0 ml 加える(c)。

4. 新たにチューブを用意し,「試料(添加あり)」,「コントロール(添加あり)」に10 × Spiking Stock Solution をそれぞれ同量添加して測定用試料を調製する*3。10 × Spiking Stock Solution 由来の標準物質の濃度が,標準曲線の中間程度の値になるよう添加量を調節する。最終容量が二重測定に十分な量になるよう調節する。
例) (d):「試料(添加あり)」980 μ l に10 × Spiking Stock Solution を20 μ l 添加する。
(e):「コントロール(添加あり)」980 μ l に10 × Spiking Stock Solution を20 μ l 添加する。

5. 調製した試料およびコントロールをボルテックスで混合する。

*2 Spiking Stock Solution の調製と希釈に用いる溶液は,ELISA キットのプロトコルを参照し,適切なものを使用して下さい。
*3 調製は,同じピペットを用いて同時に行う必要がありますが,ピペットチップはその都度交換して下さい。

試料およびコントロールの調製


V. 添加した試料/コントロールの希釈系列作製(直線性試験)

直線性試験を行うため,(d)「試料(添加あり)」と(e)「コントロール(添加あり)」の希釈系列を作製します。(a)「試料(添加なし)」の濃度がスタンダードの最高濃度の60%を超えている場合には,同様に希釈系列を作製して測定を行って下さい。
系列希釈した試料の測定値が,キットの標準曲線と同様の傾きを示すかどうかを確認することで,試料を希釈しても測定値の正確性が保たれるかを判断できます。

1. 1:2 希釈
(a)「試料(添加なし)」,(d)「試料(添加あり)」,(e)「コントロール(添加あり)」それぞれ0.5 ml に希釈溶液0.5 ml を加える。

2. 1:4 希釈
上記の1:2 希釈した各試料溶液0.5 ml にさらに希釈溶液0.5 ml を加える。

3. 1:8 希釈
上記の1:4 希釈した各試料溶液0.5 ml にさらに希釈溶液0.5 ml を加える。

希釈するたびにボルテックスで混合して下さい。


VI. アッセイの実施

キット付属のプロトコルに従い,III,IV,Vで調製した試料を用いてアッセイを行います。

プレートのウェル配置図

1 2 3 4 5 6
A スタンダード 1 試料(添加あり) コントロール( 添加あり)
B スタンダード 2 1:2 希釈の試料(添加あり) 1:2 希釈のコントロール( 添加あり)
C スタンダード 3 1:4 希釈の試料(添加あり) 1:4 希釈のコントロール( 添加あり)
D スタンダード 4 1:8 希釈の試料(添加あり) 1:8 希釈のコントロール( 添加あり)
E スタンダード 5 試料(添加なし)
F スタンダード 6 1:2 希釈の試料(添加なし)
G スタンダード 7 1:4 希釈の試料(添加なし)
H ブランク 1:8 希釈の試料(添加なし)

VII. 測定値の算出・解析

以下の計算式を使用して,測定値を算出し,解析を行います。

1. 添加回収試験

回収率(% Recovery)= 「試料(添加あり)」の測定値 -「 試料(添加なし)」の測定値 ×100
添加した標準物質の量

2. 直線性試験

・「 試料(添加あり)」の直線性を検討する場合,「試料(添加あり)」の測定値を「予測値」とする。

・「 試料(添加なし)」の直線性を検討する場合,「試料(添加なし)」の測定値を「予測値」とする。

1:2 希釈の回収率(%)= 1:2 希釈試料の測定値 ×100
予測値÷2
1:4 希釈の回収率(%)= 1:4 希釈試料の測定値 ×100
予測値÷4
1:8 希釈の回収率(%)= 1:8 希釈試料の測定値 ×100
予測値÷8

回収率80 ~ 120%が許容範囲です。

「 コントロール(添加あり)」は希釈系列が正しく作製できているかの確認に使用します。「コントロール(添加あり)」の回収率が80 ~120%にならない場合は,調製方法に問題があると考えられます。


VIII. 結論

添加回収試験および直線性試験の測定値が適切な範囲内に収まっていれば,条件未検討の適用外試料にELISA キットを使用する際の信頼度が向上します。

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R&D Systems(R&Dシステムズ)社 ELISA トラブルシューティングガイド

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A
  • ウェルの洗浄が不十分
    ・プレートウォッシャーを使用している場合,洗浄装置が正常に作動するか確認して下さい。
    ・ 洗浄の回数や時間を省略しないで下さい。
  • アスピレーションが不十分
    ・アスピレーション後,ウェル内に溶液が残っていないことを確認して下さい。
  • 洗浄の液量が不十分
    ・プロトコルで指示されている液量を守ってください。
  • 試薬の混合が不十分
    ・試薬や試料は使用前によく混合して下さい。ウェル内の試薬も十分に混合して下さい。
  • 試薬容量が不均一
    ・ピペットの性能をチェックし,必要に応じて較正を行って下さい。
    ・ピペットチップがきちんと装着されているか確認して下さい。
  • ウェルが乾燥してしまっている
    ・試薬の添加は迅速に行って下さい。
  • ピペットチップなどを再利用している
    ・ピペットチップはスタンダード,試料,試薬ごとに交換して下さい
    ・リザーバーは区画が分かれているものを使用するか,試薬ごとに交換して下さい。
    ・プレートカバーはインキュベーションごとに新しいものを使用して下さい。
A
  • スタンダード溶液の調製が間違っている
    ・スタンダードの希釈には専用の希釈溶液を使用して下さい。
    ・スタンダード溶液の種類,数が正しいか確認し,プロトコル記載の容量を守って希釈して下さい。
  • ウェルの洗浄が不十分
    ・プレートウォッシャーを使用している場合,洗浄装置が正常に作動するか確認して下さい。
    ・プロトコル記載の洗浄回数や時間を守って下さい。
  • アスピレーションが不十分
    ・アスピレーション後,ウェル内に溶液が残っていないことを確認して下さい。
  • 試薬容量が不均一
    ピペットの性能をチェックして,必要があれば再補正して下さい。
    ・ピペットの性能をチェックし,必要に応じて較正を行って下さい。
    ・ピペットチップがきちんと装着されているか確認して下さい。
  • 基質の調製が早すぎる
    調製するタイミングはプロトコル記載の手順に従って下さい。
  • 読み取り時間をオーバーしている
    プロトコル記載の読み取り時間内に測定して下さい。
  • 換算方法が間違っている
    ・プロトコル記載の計算方法を用いて下さい(他の方法では正確な標準曲線が得られない場合があります)。
A
  • Streptavidin-HRP 濃度が低すぎる
    ・Streptavidin-HRP 溶液が正確に希釈されているか確認して下さい。必要ならば Streptavidin-HRP の濃度調節を行って下さい。
  • 捕捉用抗体(Coating/Capture Antibody)がプレートに十分コートされていない
    ・ELISA 用プレートを使用して下さい(細胞培養用プレートは使用しないで下さい)。
    ・タンパク質を含まない PBS で捕捉用抗体を希釈して下さい。
    ・抗体が正確に希釈されているか確認して下さい。必要ならば抗体の濃度調節を行って下さい。
  • 検出用抗体の濃度が低すぎる
    ・抗体が正確に希釈されているか確認して下さい。必要ならば抗体の濃度調節を行って下さい。
  • 操作法が不適切
    ・キットのプロトコルに従い,再実験を行って下さい。
A
  • ウェルに加える基質の液量が不十分
    ・ピペットの性能をチェックし,必要に応じて較正を行って下さい。
    ・ピペットチップがきちんと装着されているか確認して下さい。
  • 基質の調製が間違っている
    ・基質の液量,調製方法が正しいか確認して下さい。
    ・十分に混合し,プロトコル記載の時間内に使用して下さい。
  • インキュベーション時間/温度が間違っている 指示されている
    ・プロトコル記載のインキュベーション時間と温度で反応を行って下さい。
    ・周囲の温度変化の影響を受ける場所でのインキュベーションは避けて下さい。
  • HRP /基質の不良
    ・Streptavidin-HRP とTMB 基質を等量混合して,発色することを確認して下さい。
  • 読み取り時間をオーバーしている
    ・プロトコル記載の読み取り時間内に測定して下さい。
  • 測定機器の設定が間違っている
    ・マイクロプレートリーダーが正しい波長で使用されているか確認して下さい。
    ・ルミノメーター設定が正しいか確認して下さい。
  • 反応停止液を加えた後の混合が不十分
    ・反応停止液をウェルに加えた後,溶液が緑色を示している場合は混合不足です。
  • 間違った試薬を使用している
    ・各ステップで用いる試薬が正しいか,もう一度確認して下さい。
A
  • ウェルの洗浄が不十分
    ・キットのプロトコルに従い,プレートを適切に洗浄して下さい。
    ・洗浄バッファーを加えた後,30 秒間保持してから,除去して下さい。
    ・洗浄回数を1 回増やして下さい。
    プレートウォッシャ-を使用している場合:
    ・洗浄ポートに汚れやつまりがないか確認して下さい。
    ・洗浄バッファーを加えた後,30 秒間保持する行程をプログラムに追加して下さい。
    ・洗浄行程の途中でプレートの左右の方向を変えてみて下さい。
  • プレートのブロッキングが不十分
    ・プレートのブロッキング条件とブロッキング試薬を確認して下さい。
A
  • ウェルの洗浄が不十分
    ・キットのプロトコルに従い,プレートを適切に洗浄して下さい。
    ・洗浄バッファーを加えた後,30 秒間保持してから,除去して下さい。
    ・洗浄回数を1 回増やして下さい。
    プレートウォッシャ-を使用している場合:
    ・洗浄ポートに汚れやつまりがないか確認して下さい。
    ・洗浄バッファーを加えた後,30 秒間保持する行程をプログラムに追加して下さい。
    ・洗浄行程の途中でプレートの左右の方向を変えてみて下さい。
  • スタンダードや試料が均一ではない
    ・使用前にスタンダードや試料を十分混和して下さい。
  • 血清・血漿サンプルの添加量が正確ではない
    ・プレートに試料を添加する前に,ピペットチップの先に付着している試料を十分拭き取って下さい。
  • インキュベート時の温度条件がばらついている
    ・推奨反応温度を守って下さい。
    ・温度変化が激しい場所ではインキュベートを行わないで下さい。
  • 測定ごとにプロトコルを改変している
    ・測定間でプロトコルの改変を行わないで下さい。
  • バッファーが汚染されている
    ・バッファーを再度作製して下さい。
A
  • 試料中に測定物質が存在しない
    ・ポジティブコントロールを設定して下さい。
    ・実験条件や試料採取・保存方法等を確認して下さい。
  • 試料中に測定妨害物質が存在する
    ・適切な試料希釈液を用いて,試料を希釈して下さい(最低でも3 倍希釈する)。可能であれば数段階の試料希釈列を作製し,測定を行って下さい。
  • 試料が適切に保存されていなかった
    ・試料の保存条件・保存可能期間を確認して下さい。
  • 試料が凍結融解を繰り返されていた
    ・試料の再凍結保存は行わないで下さい。
A
  • 試料中に測定物質が過剰に存在する
    ・試料を希釈し,再度測定して下さい。
A
  • Streptavidin-HRP または TMB 基質が劣化している
    ・Streptavidin-HRP とTMB 基質を等量混合して,発色することを確認して下さい。
  • Streptavidin-HRP の濃度が低すぎる
    ・抗体濃度を変更した場合には,Streptavidin-HRP 濃度も再調製して下さい。
  • 捕捉用抗体または検出用抗体の濃度が低すぎる
    ・各抗体の希釈倍率がプロトコルに合っているか確認して下さい。
  • プレートリーダーの測定波長が誤って設定されている
    ・プレートリーダーの測定波長を正しく設定して下さい。
  • 発色反応が十分進んでいない
    ・TMB 基質との反応時間を延長して下さい。
  • 捕捉用抗体をコートしたプレートが劣化している
    ・新たに捕捉用抗体をコートしたプレートを作製して下さい。
  • 捕捉用抗体がプレートに十分コートされていない
    ・ELISA 用プレートを使用して下さい(細胞培養用プレートは使用しないで下さい)。
    ・タンパク質を含まない PBS で捕捉用抗体を希釈して下さい。
  • プレートを洗浄後にウェルが乾燥してしまった
    ・プレートを洗浄後,速やかに次のステップに進んで下さい。
  • ピペットチップ等でウェルを引っかいてしまった
    ・新しいウェルで再度測定を行って下さい。
A
  • TMB 基質が汚染している
    ・プレートに加える前に,TMB 基質が無色であることを確認して下さい。
A
  • アッセイの準備を断続的に行っている
    ・使用する試薬類はすべてアッセイを開始する前に準備して下さい。
    ・スタンダードや試料は20 分以内にプレートへ加えて下さい。
  • ルミノメーターの設定が間違っている
    ・化学発光の測定は1.0 秒/ウェルで読み取りを行って下さい(2.0 秒以上で読み取りを行うと,最初のウェルから最後のウェルまで読み取る間に時間がかかり,誤差の原因となります)。
  • インキュベーション時間/温度設定が間違っている
    ・プロトコル記載のインキュベーション時間と温度で反応を行って下さい。
    ・周囲の温度変化の影響を受ける場所でのインキュベーションは避けて下さい。
  • 試薬の温度が室温になっていない
    ・プロトコル中で特に指示のない場合は,使用前にすべての試薬が室温状態にあるか確認して下さい。
  • 測定場所の温度条件が一定でない(Edge effect が見られた)
    ・温度変化が激しい場所ではインキュベートを行わないで下さい。
    ・プレートシーラーを使用して下さい。
Quantikine ELISA Kit Quantikine ELISA Kit

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(テクニカルサポート 試薬担当)

reagent@funakoshi.co.jp

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