Glysite Scout Glycan Screening Kitの操作方法

by Sierra Cotton

Glysite Scout Glycan Screening Kitの概要

キットに含まれるレクチンの反応性

レクチン	結合モチーフ	分類
AAL（Aleuria Aurantia）	αFuc	フコース
ECL、ECA（Erythrina Cristagalli）	Terminal type 2 LacNAc, Terminal type 2 LacdiNAc	ガラクトースおよびLacNAc
GNL（Galanthus Nivalis）	Terminal α1-3 or α1-6 mannose	マンノース
Jacalin	Core 1 and 3 O-glycans、3-substituted GalNAcα	コアO-glycan
MAL II（Maackia Amurensis Ⅱ）	α2-3-sialylated Galβ1-3GalNAc in O-glycans、3' sulfated βGal	シアル酸および硫酸化
PHA-L（Phaseolus Vulgaris Leucoagglutinin）	β1-6 branched N-glycans、Binds tri- and tetraantennary	複合型N-glycan
WFA、WFL（Wisteria Fluoribunda）	Terminal GalNAcβ, Terminal GalNAcα, Terminal multiantennary LacNAc	GalNAc
WGA（Wheat Germ Agglutinin）	Terminal GlcNAcβ, Terminal GlcNAcα, Terminal NAc containing glycans	GlcNAcおよびキチン

操作方法

試薬調製

1. Carbo-Free Blocking Solutionは、脱イオン蒸留水（Deionized、DI）で10倍希釈する。
2. 2 mg/mlのビオチン標識レクチンは、PBSで2～10 μg/mlに希釈する。
3. 1 mg/mlのDyLight標識ストレプトアビジンは、PBSで10 μg/mlに希釈する。

試料調製

1. パラフィン包埋切片は、キシレンやアルコールなどを用いて脱パラフィンおよび浸水処理をする。
   凍結切片および培養細胞は、アセトンまたは適切な固定液で固定する。
2. 必要に応じて、Antigen Unmasking Solution（#H-3300）またはAntigen Unmasking Solution, High pH（#H-3301）を用いて抗原賦活化処理を行う。

ブロッキング処理

1. ブロッキング処理の前に、試料スライドを水道水で5分間洗浄する。
2. 試料に内在性のビオチン、ビオチンレセプターとアビジン結合部位、またはストレプトアビジン結合部位が含まれる場合は、Streptavidin/Biotin blocking solutionを用いてブロッキングを行う。
   ■ 方法
   1. 試料スライドに組織を覆う量のStreptavidin blocking solutionを滴下する。
   2. 15分間インキュベーションを行う。
   3. 試料スライドをバッファーで軽くすすぎ、染色ジャーを用いて5分間浸けて洗浄する。
   4. 試料スライドに組織をが覆う量のBiotin blocking solutionを滴下する。
   5. 15分間インキュベーションを行う。
   6. 試料スライドをバッファーで軽くすすぎ、染色ジャーを用いて5分間浸けて洗浄する。
3. Carbo-Free blocking solutionを用いて、非特異的結合の阻害を行う。
   ※ 他のブロッキング液にはレクチン結合を妨げる糖タンパク質が含まれる場合があるため、必ずCarbo-Free blocking solutionを使用して下さい。
   ■ 方法
   1. 試料スライドに組織を覆う量のCarbo-Free blocking solutionを滴下する。
   2. 30分間インキュベーションを行う。
   3. 試料スライドをバッファーで軽くすすぎ、染色ジャーを用いて5分間浸けて洗浄する。

ビオチン標識レクチンの反応

1. 試料スライドに組織を覆う量の希釈したビオチン標識レクチンを滴下する。
2. 30分間インキュベーションを行う。
3. 試料スライドをバッファーで軽くすすぎ、染色ジャーを用いて5分間浸けて洗浄する。

DyLight標識ストレプトアビジンの反応

1. 試料スライドに組織を覆う量の希釈したDyLight標識ストレプトアビジンを滴下する。
2. 遮光し、30分間インキュベーションを行う。
3. 試料スライドをバッファーで軽くすすぎ、染色ジャーを用いて5分間浸けて洗浄する。

褪色防止封入処理

1. 試料スライドにVECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium with DAPIを滴下し、封入する。
   ※ カバーガラス下に気泡が発生するリスクを軽減するために、余分なバッファーを軽く拭き取ってから封入して下さい。また、カバーガラスの端から余分な液体が滲み出るのを防ぐため、カバーガラス（22 mm×22 mm）あたり約25 μlを滴下して下さい。
2. 遮光し、平らで乾燥した所に置き、硬化させる。
   ※ 試料スライドは封入後30分で観察可能ですが、最適な褪色防止効果を得るためには、少なくとも2時間お待ちいただくことをお勧めします。

操作方法動画

レクチンガイドのご案内

キット内容

• Carbo-Free blocking solution
• VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium with DAPI
• Streptavidin blocking solution
• Biotin blocking solution
• Streptavidin、DyLight 488（#GSK-3000のみ）
• Streptavidin、DyLight 594（#GSK-2000のみ）
• Streptavidin、DyLight 649（#GSK-1000のみ）
• AAL（Aleuria Aurantia）、biotinylated
• ECL、ECA（Erythrina Cristagalli）、biotinylated
• GNL（Galanthus Nivalis）、biotinylated
• Jacalin, biotinylated
• MAL II（Maackia Amurensis Ⅱ）、biotinylated
• PHA-L（Phaseolus Vulgaris Leucoagglutinin）、biotinylated
• WFA、WFL（Wisteria Fluoribunda）、biotinylated
• WGA（Wheat Germ Agglutinin）、biotinylated

価格