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メーカー：	Horizon社Dharmacon製品 OriGene Technologies
	Horizon社Dharmacon製品(メーカー略称：DHA)のRNAiコレクション，cDNAコレクション，Yeastコレクションなど，遺伝子機能研究に有用な遺伝子リソースを検索することができます。クローンコレクション検索の使い方はこちら OriGene Technologies社(メーカー略称：ORI)のTrueClone / TrueORF / TrueORF Gold cDNAクローンなど，遺伝子機能研究に有用な遺伝子リソースを検索することができます。クローンコレクション検索の使い方はこちら
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ゲノム編集により目的とする内在性遺伝子のC末端にタグを組み込むシステム OmniTagシステム

掲載日情報：2023/01/18 現在Webページ番号：70768

システムバイオサイエンス /
System Biosciences, LLC
[メーカー略称：SBI]

ゲノム編集により、培養細胞のゲノム中に存在する内在性遺伝子のC末端に☞ 様々なタグを導入するシステムです。標的遺伝子に対するgRNA、タンパク質翻訳のフレーム合わせ、および導入するタグの計3種類のベクターをコトランスフェクションすることにより、効率的にタグを導入することができます。

※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

内在性TUBB（tubulin beta class Ⅰ）へのGPFタグの導入

HEK293細胞に、TUBBを標的としたgRNAを組み込んだCas9 all-in-one Vector、F1 Frame Selector、およびOmniTag GFP-Puro minicircle donorの3つのベクターをコトランスフェクションした。トランスフェクション後2～4日間、1 μg/mlの選択用ピューロマイシンを細胞培養培地に添加した。4～7日後に、ピューロマイシン陽性クローンが得られる。蛍光顕微鏡により、TUBBの細胞内局在に対応したGFPの蛍光が観察された。

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OmniTagシステムとは
製品ラインナップ
特長
導入するタグおよび適用の例
操作方法概略
使用例
価格

OmniTagシステムとは

内在性遺伝子のC末端にタグを導入する場合において、タグが目的タンパク質と融合して一緒に翻訳されるように、ゲノム編集によりストップコドンの除去およびフレーム合わせを行う必要があります。OmniTagシステムは、これらの課題を解決し、あらゆる内在性遺伝子のC末端へのタグの導入を簡便に行うことができます。
本システムでタグの導入に用いるOmniTag Minicircle Donorは、ゲノム中に完全に組み込まれる☞ Minicircle DNAであり、以下のような重要な機能を提供します。

細菌のプラスミドDNA配列などの外来DNAを含まないため、免疫応答を低減できます。
サイズが小さいため、より効率的なトランスフェクションが可能となり、1 μg DNA当たりのコピー数が向上します。

参考文献

Schmid-Burgk, J.L., et al., "CRISPaint allows modular base-specific gene tagging using a ligase-4 dependent mechanism.", Nat. Commun., 7, 12338 (2016). [PMID:27465542]

OmniTagシステムを用いた目的遺伝子のC末端へのタグ導入の原理

OmniTagシステムは、以下の3つのコンポーネントで構成されています。

☞ PrecisionX Cas9 SmartNuclease All-in-one Vectorsまたは同等のオールインワンのCas9/gRNAベクターに目的遺伝子に対するgRNAを組み込み、ゲノム中の目的遺伝子の終止コドンのすぐ上流の箇所に二本鎖切断を導入します。
OmniTag Frame Selector Vectorの3種類のベクターは、OmniTag Minicircle Donor中に存在するFrame Selector Linkerの3種類のポジション（F0、F1、F2）にそれぞれ対応したgRNAと、Cas9が組み込まれた all-in-one Vectorで、タグのin-frame融合に用います。
OmniTag Minicircle Donorは、Frame Selector Linkerと目的タグ配列、さらにT2A配列の下流に選択マーカーが組み込まれたミニサークルDNAであり、OmniTag Frame Selector Vectorによって線状化された後に、NHEJによってゲノム中に完全に組み込まれます。

これらの3つのベクターを標的細胞にコトランスフェクションすると、協調して機能し、Ligase 4依存性の非相同末端結合（NHEJ）を介してゲノム中でC末端へのタグの導入が行われます。

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製品ラインナップ

商品コードをクリックすると各製品の価格表をご覧いただけます。

OmniTag Frame Selector Vector（目的遺伝子とタグの翻訳フレーム合わせ用ベクター）

品名	Cas9発現プロモーターの種類	フレームの種類	商品コード
OmniTag Frame Selector Vector	CMV	F0	OT100-F0
		F1	OT101-F1
		F2	OT102-F2
	EF1α	F0	OT200-F0
		F1	OT201-F1
		F2	OT202-F2

※ 3種類（OmniTag F0～F2）のFrame Selecter Vectorをまとめてご注文いただくことも可能です。詳細は、☞ 当社テクニカルサポート（試薬担当）までお問い合わせ下さい。

pA OmniTag Minicircle Donor（タグ導入用ベクター）

品名	導入タグ	選択マーカー	商品コード
pA OmniTag Minicircle Donor	copGFP	Puro	OT501MC-1
	RFP	Blast	OT502MC-1
	6×His	Puro	OT503MC-1
	3×Flag	Puro	OT504MC-1

※ ☞ Syn2Cloneベクター構築（クローニング）受託サービスでは、ご希望のタグと選択マーカーを組み込んだOmniTag Minicircle Donorをご注文いただけます。詳細は当社受託・特注品担当までお問い合わせ下さい。

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特長

タグ配列を組み込んだMinicircle Donorはあらゆる遺伝子に対して使用でき、目的遺伝子に特異的なものを構築する必要はありません。
Minicircle Donorはready-to-useで、外来性DNAは含まれていません。
Frame Selector Vectorは、Cas9発現に用いるプロモーターをCMVまたはEF1αから選択できます。
高効率で、簡便性が高いモジュール方式を採用しており、抗生物質による選択後のタグ陽性細胞率は≧90％です。
順次操作を行うことにより、同じ細胞中の異なる遺伝子に個別のタグを導入することができます。
内在性遺伝子発現の定量化、タンパク質局在解析、および免疫沈降において、目的タンパク質に対する抗体を用いない手段を提供します。

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導入するタグおよび適用の例

ルシフェラーゼ（T2A-Gaussia Luciferase, NanoLuc）タグを目的タンパク質に融合し、化学発光により発現を測定する。
様々な蛍光タンパク質（TagGFP2、TagBFP、TagRFP、T2A-TurboGFP-PEST）を目的タンパク質に融合し、蛍光により細胞局在の確認やFACS解析を行う。
低分子のエピトープタグ（HA、Myc、Strep tag Ⅱ、ストレプトアビジン結合ペプチド、AviTag、SpyTag、SunTag）を目的タンパク質に融合し、高感度検出やアフィニティ精製を行う。
制御可能な不安定化ドメイン（ProtoTuner DD）を目的タンパク質に融合し、遺伝子発現の切り替え制御を行う。
分割タグ（split-TEVプロテアーゼ）を複数の目的タンパク質に融合し、タンパク質間相互作用を評価する。

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操作方法概略

①：目的遺伝子に対するgRNA配列とOmniTag Frame Selector vectorの選択

タグを導入する目的遺伝子に対するgRNA配列の決定と、翻訳フレーム合わせに用いるFrame Selector Vectorの選択を行います。

以下のリストには、ヒト・マウスそれぞれについて、ほとんどの遺伝子における適切なgRNA配列とFrame Selector Vectorの種類が掲載されています。

☞ ヒト遺伝子（）
☞ マウス遺伝子（）

②：ベクターの構築

①で決定した目的遺伝子に対するgRNA配列を☞ PrecisionX Cas9 SmartNuclease All-in-one Vectorsなどのall-in-one Cas9ベクターにクローニングします。

③：co-transfection

gRNA配列を組み込んだCas9 all-in-one Vector、OmniTag Frame Selector Vector、およびOmniTag Minicircle Donorを標的細胞にコトランスフェクションします。

④：選択／スクリーニング

クローンの選択またはスクリーニングを実施します。

⑤：検証

遺伝子型解析、蛍光顕微鏡解析、ウエスタンブロッティング、シークエンシングなどにより、タグを導入した目的遺伝子の発現を検証します。

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使用例

OmniTagシステムによるタグの導入の正確性のPCRによる確認

TUBBへのタグの導入について、TUBBとタグがまたがった領域を標的としたPCR（ジャンクションPCR）、およびタグ全体を標的としたPCR（インサーションPCR）で確認を行った。

TUBB 5'ジャンクションPCR

TUBB 3'ジャンクションPCR

TUBB GFP-puroインサーションPCR

図をクリックすると拡大します（拡大図）

ピューロマイシン選択後、得られた複数のクローンを増殖し、続いてゲノムDNAの抽出とPCRを行った。
TUBB-fwdおよびcopGFP-revプライマーを5'ジャンクションPCRに使用し、puro-fwdおよびTUBB-revプライマーを3' ジャンクションPCRに使用した。
TUBB-fwdおよびTUBB-revプライマーをインサーションPCRにに使用した。
ゲル電気泳動により、すべてのクローンにおいて予想されたアンプリコンが含まれていることが示され、TUBBのC末端にcopGFPタグが正確に挿入されたことが確認された。

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OmniTagシステムによる2種類のタグの導入

HEK293細胞において、H4C3へGFPを、TUBBへRFPをタグ導入した。

図をクリックすると拡大します（拡大図）

HEK293細胞へ、H4C3に対するgRNAを組み込んだCas9 all-in-one Vector、F1 Frame Selector Vector、OmniTag GFP-Puro Minicircle Donorをコトランスフェクションした。
トランスフェクション後2～4日間、1μg/mlのピューロマイシンを細胞培養培地に添加した。
4～7日後に、ピューロマイシン陽性クローンが得られた。
3.で得られた細胞に、続けて、TUBBに対するgRNAを組み込んだCas9 all-in-one Vector、F1 Frame Selector Vector、OmniTag RFP-Blast Minicircle Donorをコトランスフェクションした。
トランスフェクション後2～4日間、7 μg/mlのブラストサイジンを細胞培養培地に添加した。
4～7日後に、ブラストサイジン陽性クローンが得られた。
蛍光顕微鏡観察により、H4C3へのGFPタグ融合、およびTUBBへのRFPタグ融合が確認され、またそれぞれのタンパク質の細胞内局在に一致することが示された。

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