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エクソソーム由来RNAからcDNAを合成するキット EVery cDNA Synthesis Kit

掲載日情報:2022/09/26 現在Webページ番号:70755

エクソソーム(Exosome)などの細胞外小胞(EV、extracellular vesicle)から抽出・精製したsmall RNAを含む全RNAから簡便、迅速にcDNAを合成するキットです。エクソソームからのRNA抽出キットであるEVery EV RNA Isolation Kit(#EVery100B-1)と組み合わせてご使用いただくことをお勧めします。

本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

比較例

miRNA回収率の比較

miRNA回収率の比較
SmartSEC Single(#SSEC200A-1)を用いて血清250 μlから単離したエクソソームに0.1 pmolのCel-miR-39を添加し、EVery EV RNA Isolation Kit(#EVery100B-1)またはフェノールベースのキットを用いてRNAを単離した。それぞれ単離したRNAを本製品を用いて逆転写した後に、Cel-miR-39のコピー数を測定した。EVery EV RNA Isolation Kit(#EVery100B-1)は、フェノールベースのキットを用いた場合とほぼ同等のCel-miR-39のコピー数が得られた。

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特長

  • EVery EV RNA Isolation Kit(#EVery100B-1)と組み合わせての使用に最適化されており、簡便な操作で2時間以内にcDNAを合成することができます。
  • 合成したcDNAは、PCR、qPCR、miRNAプロファイリングなど、ほとんどの下流のアプリケーションで使用できます。
  • EVery miRNome Profiler for Human Serum and Plasma(#EVery500B-1)で、8回のプロファイリングを行うのに十分な量のUniversal reverse primerが、キットには含まれています。
  • 使用回数:20 reations

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操作方法概略

本製品は、エキソソームRNAにpoly(A)テールを付加した後に、MMLV Reverse Transcriptaseによる逆転写でcDNAを合成します。本法では、MMLV Reverse Transcriptaseの有するテンプレートスイッチング特性を利用した5'-末端側と3'-末端側の2つのアダプタープライマーでcDNA分子を合成します。合成したcDNAは、キット付属のEVERY miRNome universal reverse primerを用いて、発現をqPCRで検出することができます。

EVery cDNA Synthesis Kitのワークフロー

図をクリックすると拡大します(拡大図

EVery cDNA Synthesis Kitのワークフロー

  1. 以下の反応液を準備する。
  2. コンポーネント 容量
    Poly(A) tailing reaction buffer 2 μl
    ATP 1 μl
    Poly(A) tailing enzyme 0.5 μl
    RNase inhibitor 0.25 μl
    EVs RNA X μl
    RNase free water Up to 10 μl

  3. 反応液を穏やかに混合し、軽く遠心分離を行う。
  4. 37℃で20分間インキュベートする。
  5. cDNA合成に用いるために、Oligo(dT)-Adaptorを加える。
  6. 72℃で3分間インキュベートし、次に氷上で2分間インキュベートする。
  7. 第1鎖cDNA合成反応用に、以下のコンポーネントを追加する。
  8. コンポーネント 容量
    First strand buffer 5 μl
    dNTPs 2 μl
    DTT 2 μl
    TS oligo- Adaptor 1 μl
    First strand synthesis enzyme 2 μl
    RNase free water Up to 25 μl

  9. 装置のリッドを42℃にあらかじめ加熱したサーマルサイクラーにチューブをセットし、以下のサーマルサイクリングを実行する。
  10. 温度 時間
    42℃ 90分
    70℃ 10分
    40℃ forever

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キット内容

  • Poly(A) tailing reaction buffer
  • ATP
  • Poly(A) tailing enzyme
  • RNase inhibitor
  • RNase free water
  • Oligo(dT)-adaptor
  • First strand buffer
  • DTT
  • dNTPs
  • TS oligo-adaptor
  • First strand synthesis enzyme
  • Universal reverse primer

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関連製品 EVery miRNA Spike-in Kit

内在性miRNAに類似したサイズの合成RNAのSpike-in controlと、qPCR検出用のForward primerのセットです。それぞれのSpike-inが最適な濃度で混合されているため、試料中に存在する低濃度~高濃度の内在性miRNAのコントロールとして有用です。RNA抽出ステップ(Spkn1~3)とcDNA合成ステップ(Spkn4とCel-miR-39)のそれぞれの操作前に試料に添加することにより、各ステップにおける効率の評価、および逆転写とPCR増幅時の阻害物質による影響の検証に役立ちます。

EVery miRNA Spike-in Kit

図をクリックすると拡大します(拡大図

ヒト血清・血漿試料からのmiRNA抽出およびcDNA合成についてのEVery miRNA Spike-in Kitを用いた検証

キット内容

  • Spkn1, Spkn2, Spkn3 RNA Spike-in mix
  • Spkn4, cel-miR-39-3p RNA Spike-in mix
  • Spkn1 / Spkn2 / Spkn3 / Spkn4 forward primers
  • cel-miR-39-3p forward primer

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価格

EVery cDNA Synthesis Kit

[在庫・価格 :2024年12月10日 00時01分現在]

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EVery miRNA Spik-in Kit(100assays)
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EVery miRNA Spik-in Kit(100assays)

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お問い合わせ先

(テクニカルサポート 試薬担当)

reagent@funakoshi.co.jp

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